肾炎2号对IgA肾病大鼠a-V平滑肌肌动蛋白表达实验探究.docVIP

肾炎2号对IgA肾病大鼠a-V平滑肌肌动蛋白表达实验探究摘要：目的：探讨肾炎2号对lgA肾病大鼠肾小球内a-平滑肌肌动蛋白(a―SMA)表达的影响。方法：使用口服和尾静脉注射牛血清白蛋白(BSA)的方法进行IgA肾病模型的制作，治疗组、对照组造模同时分别给予肾炎2号(15g／kg)和福辛普利(4.17mg／kg)至12周末。观察尿常规,24h尿蛋白定量、肾组织的病理改变及肾小球内a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达。结果：①第7～12周末模型组的24h尿蛋白定量明显高于正常组、治疗组与对照组(P0.05)。结论：肾炎2号具有减轻肾小球内a-SMA的表达的作用。 关键词：lgA肾病；肾炎2号；a-平滑肌肌动蛋白(a―SMA)；蛋白尿 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2007)11-2398-04 a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)是血管平滑肌细胞表型转化的标志，在各种病理疾病中其表达增加，使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进纤维化的发展。它是肾小球疾病系膜细胞受损激活和表型转化的标志，同时作为肌成纤维细胞的特异性标志蛋白，可能也是预测肾间质纤维化进展的理想指标。为此笔者通过复制IgA肾病模型来探讨肾炎2号对实验肾炎大鼠肾小球内a-SMA表达的影响，以期初步探讨肾炎2号治疗IgA肾病可能的作用机制，为其肾脏保护作用提供更完善的实验依据。 1　材料 1.1　实验动物及分组SD纯种大白鼠，雌性，体重(140±10)g，12周龄，浙江中医药大学动物实验中心提供。动物适应性喂养1周后，将尿常规阴性动物随机分为正常组、模型组、西药对照组、中药治疗组4组，每组各10只。 1.2　试剂牛血清白蛋白(BSA)，宝灵曼公司提供；Poly-donalAntibody，Goat　Anti　RatlgA Ftie，Seroet Ltd提供；鼠抗人a－平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司提供；二步法抗鼠／兔通用型免疫组化试剂盒，Gene Tech(Shanghai)Company Limited提供；肾炎2号(由生黄芪、雷公藤、制军、红花、金银花等颗粒剂组成，江苏江阴天江药业有限公司，浙江省中医院中药房配制)，稀释成1.5g／mL的溶液：福辛普利片刹(剂量10mg)，上海施贵宝有限公司，用蒸馏水稀释成4.17rag／kg的溶液。 2　方法 IgA肾病模型制备参照Emancipator等报道的方法，即隔日口服含0.1％BSA的酸化水，6周后定期尾静脉注射1％BSA缓冲液(每日1次，连续3次)，然后观察至第12周末。中药治疗组、西药对照组的造模与模型组相同，并于造模开始即分别用肾炎2号(剂量为15g／kg)、福辛普利片(4.17mg／kg)灌胃给药，至第12周末。正常组隔日口服酸化水，共12周。 在上述12周内，各组动物进食进水量不限。从第7周末起用代谢笼留尿，每周查尿常规及24h尿蛋白定量。实验动物在12周末，禁食12h,3％戊巴比妥钠麻醉大鼠后，剖腹，取出双肾，分3部分，供光镜、免疫组化、免疫荧光检测。 统计方法：运用SPSS11.5统计软件进行数据处理，本文资料均用x±s表示；采用单因素方差分析，组间比较采用s-N-Q检验。 3　检测项目 3.1　尿常规及沉渣镜 检尿常规采用LINITEK 500尿常规分析仪检测；24h尿蛋白定量：比色法。 3.2　肾组织光镜观察 所取组织用10％福尔马林固定液固定，由LEICA RMIB5切片机切成3pan厚的切片，用HE常规染色，最后在olympus BX60光学显微镜下观察肾组织的病理形态学的改变。 3.3 肾组织免疫荧光观察 用组织包埋剂OCT将新鲜组织包埋后，液氮速冻，由LEICA CM1850冰冻切片机切成4μm后的切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上室温晾干。放入PBS内轻洗1min×3次。滴加羊抗大鼠免疫荧光IgA(异硫氢荧光素标记)抗体稀释液，37℃避光孵育45min。用蒸馏水轻洗1min(三道)后用纸吸干切片表面的水液，即刻在LEICA TCS-SP型激光共聚焦显微镜显微镜下观察。 3.4　肾组织免疫组织化学检 查肾组织常规10％福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切片厚度2μm。按Envision二步法进行操作。以胞质出现棕黄色染色为阳性信号，采用LEICA病理图象分析系统，每张切片在显微镜下(×200倍)随机选取15个不重复的肾小球视野，测量每个肾小球中着色的阳性面积及整个肾小球的面积，以二者的比值表a―SMA在肾小球内表达的阳性面积西分比。 4　结果 从第7周末起的尿常规沉渣镜检均未见有红细胞，但有出现蛋白尿(