胃癌康诱导SGC-7901人胃癌细胞株调亡实验探究.docVIP

胃癌康诱导SGC-7901人胃癌细胞株调亡实验探究摘要：目的：探讨胃癌康方对人胃癌细胞株的抑制与诱导凋亡的作用。方法：以人胃腺癌细胞株SGC-7901为实验模型，利用血清药理学的方法，制备中药组大鼠血清PRMI 1640培养液，浓度为10%。制备顺铂西药组大鼠血清PRMI 1640培养液，浓度为10μL/mL。对SGC-7901人胃癌细胞株施加处理因素24h。在光、电镜下观察细胞凋亡的的形态学变化。 结果：①光镜下，HE染色药物组细胞，由梭形细胞变为圆形或卵圆形，核染色质密集。②电镜下细胞变圆，微绒毛及突起明显减少，伪足消失，线粒体空泡化。核染色质凝集，可见调亡小体。凋亡细胞发生率与药物浓度呈正相关。结论：胃癌康方具有诱导SGC-7901人胃癌细胞株调亡作用。? 关键词：胃癌康；SGC-7901人胃癌细胞株； 电镜；细胞凋亡? 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2007）04-0741-03 胃癌康方，是本校经临床验证治疗胃癌的有效方剂，由三棱、莪术、乳香、没药、元胡、蟾蜍、天仙藤、甘草等组成，为进一步探讨其机制，本实验通过诱导SGC-7901人胃癌细胞株调亡来研究胃癌康方抗肿瘤作用的机制。? 1材料与方法? 1．1细胞株SGC-7901胃癌细胞株，由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。? 1．2试剂小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品，1640培养基：美国GIBCOBRL公司产品，胰蛋白酶：华美生物工程有限公司产品。化疗药物顺铂(DDP)、胎牛血清、庆大霉素等均为国内产品。胃癌康方药（三棱、莪术、乳香、没药、元胡、蟾蜍、天仙藤、甘草等）由辽宁省中医院药局提供。? 1．3动物SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。? 1．4主要仪器设备超净工作台（苏州净化设备厂）、CO2培养箱（Heraeus，德国）、倒置显微镜（OLYMTUSCK-40F200）、微量加样器、无菌吸头、微孔滤膜（0.22μm、0.45μm），离心管，紫外灯，冰箱，高压蒸汽消毒锅、透射电镜（JEM―1200。）、Sorval RC 28s型低温高速离心机等。? 1．5细胞培养与中药制剂制备①SGC-7901胃癌细胞株在10%小牛血清PRMI 1640培养液中，100%湿度，5% CO2，37℃条件下，CO2培养箱中常规培养。②中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。? 1．6含药血清制备30只SD大鼠随机分为3组，中药组10只，对照组10只，化疗组10只，即时血清在实验前禁食12h，次日采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃1mL中药制剂，采用胃肠道给药的血清药理学方法，在制备含药血清的过程中，3天血清采用中药组2mL胃癌康日2次连续灌胃3天。对照组、化疗组生理盐水等量等次灌胃3天，采血时相：分别在末次给药后lh、2h、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤、56℃30min灭活，-20℃保存，备用。? 1.7血清分组及药物处理分为正常血清对照组（对照组），药物血清组（中药组），西药组（DDP组）。药物血清温育液的制备：①药物血清组：临用前将中药组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度分别为5％、10%、20%。②对照组：对照组大鼠血清加入RPMI 1640培养液，浓度10%。③DDP组：用含10%顺铂组大鼠血清RPMI 1640培养液配制，DDP的终浓度为5μL／mL（小），10μL／mL（中），20μL／mL（大）。将培养瓶、培养皿置于37℃，5%CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。培养24h后，取材制作标本。? 1．8标本制备①HE染色法：对原位接种培养于载片的中、西药组与对照组各2张以上的细胞，进行常规HE染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。观察中、西药与对照组细胞形态学改变。②透射电镜标本制备：中、西药组与对照组生长在培养瓶内的贴壁细胞用2．5％戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，将悬浮细胞转至离心管内，低温高速离心机离心2000r／min，15min，用琼脂处理成块，磷酸缓冲液（PBS）冲洗，l％锇酸（OsO?4）后固定1.5h，梯度乙醇和丙酮脱水，EPon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V型）切片，醋酸铀和柠橡酸铅双重染色，透射电镜下观察中、西药组与对照组引起肿瘤细胞超微结构改变及诱导癌细胞的凋亡现象。?