蜂毒素抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验探究.docVIP

蜂毒素抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验探究摘要：目的：研究蜂毒素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用。方法：建立鸡胚绒毛尿囊膜模型，光镜下观察蜂毒素对正常鸡胚绒毛尿囊膜微血管形态的影响，应用医学图像分析软件定量检测蜂毒素对鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成的影响。结果：光镜下可见经蜂毒素作用后，鸡胚绒毛尿囊膜微血管数目减少，管径变细，分布零乱。定量检测结果表明，蜂毒素浓度为：2.O、4.0、8.0μg/mL时的血管生成抑制率分别为：12.11％、29.85％和45.09％，血管数目明显少于生理盐水对照组(P4.01μg/mL时，鸡胚存活率开始下降。 2.2蜂毒素对CAM血管形态的影响　实验结果显示，生理盐水组CAM血管生长良好，呈叶脉样、放射状分布，结构清晰，主血管粗状，长势旺盛(图1A)。蜂毒素及沙利度胺组新生毛细血管生成受到明显抑制，血管密度降低，管径变细，结构被破坏，呈模糊或透明样结构，颜色变浅，血管分支多处断开，分布零乱，甚至产生视觉可见的无血管区域，未见周围血管呈放射状朝向载体生长的“血管辐辏现象”，也未发现主干血管向载体弯曲和靠近的“血管吸引现象”。实验结果显示，蜂毒素各组随着用药浓度的增大其抑制作用愈加明显(图1B～D)。 2.3蜂毒素对CAM血管生成的影响　应用MIQAS医学图像分析软件对CAM照片进行分析。结果显示，在以载体为中心直径5mm范围内，蜂毒素各组及沙利度胺组CAM微血管数目明显少于生理盐水组，组间差异具有统计学意义(P0.01)。随着药物浓度的增大，蜂毒素对CAM血管的抑制作用更加显著，呈明显的浓度依赖关系。蜂毒素 各组与沙利度胺组比较差异也具有统计学意义(p0.01)，其中以沙利度胺的抑制作用最为明显，其抑制率高达61.59％，见表1。 3.讨论 血管生成是指血管内皮细胞从现有的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程。自1971年Folkman首次提出肿瘤的生长和转移具有血管依赖性之后，就如何抑制血管生成、破坏肿瘤血管已经成为肿瘤防治研究的热点和突破口。血管生成是肿瘤生长的必要条件，直径超过1～2mm的实体瘤的生长需要新生血管的介入和支持。肿瘤生长包括两个明显不同的阶段，即无血管生长期和有血管生长期。新生血管保证了肿瘤持续生长所需营养物质的有效供给，它是促成肿瘤从无血管的缓慢生长阶段向有血管的快速生长阶段转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤体积不会超过1～2mm3(大约105～106个肿瘤细胞)。有研究表明，对肿瘤组织中已经存在的血管和/或正在血管生成的肿瘤进行干预，阻断诱导血管生成的通路，能够有效地抑制肿瘤增殖和生长，使其处于休眠状态。 随着科学技术的发展，人们试图寻找抗肿瘤作用强而毒副作用小的新型抗肿瘤药物。传统中药及其提取成分在当前肿瘤治疗中的作用日益受到重视。有研究表明，一些从天然药物中提取的小分子物质具有抗肿瘤血管生成作用，它们可以抑制血管内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡。蜂毒是由中华蜜蜂Apis cerana Fabficius或意大利蜜蜂A.meUifera Lirmaeu毒腺产生并贮存于毒囊内，当受刺激时从其尾部螫针排出的一种毒汁。祖国医学应用蜂毒治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎等疾病取得较好疗效。蜂毒素是从蜂毒中提取、纯化的一种小分子肽类物质，约占蜂毒干重的50％。本实验室既往研究表明，蜂毒素在体外对人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402、Hop-3B等多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用。体内实验显示，蜂毒素可以抑制小鼠H22移植瘤的生长，并呈剂量依赖关系。本研究结果表明，蜂毒素对CAM血管生成具有明显的抑制作用，表现为给药组新生血管密度降低，管径变细，血管分布杂乱，部分血管出现断裂，颜色变浅。CAM照片经计算机分析表明，蜂毒素对CAM血管的抑制作用呈浓度依赖关系。统计结果显示，沙利度胺对CAM血管生成的抑制作用最强，其抑制率高达65.04％，这一结果与文献报道相似。 鸡胚绒毛尿囊膜法是研究抗血管生成药物经典的体内实验方法。在剔除其他干扰因素情况下，通过探讨药物对CAM血管生成的抑制作用，可直接证明药物的抗血管生成功效。由于CAM实验方法简单、方便、价格便宜、观察指标明了，因此，适合于大规模药物筛选。传统的CAM法有蛋壳开窗法和平皿法两种，以后有研究者对其进行了改进。目前，该方法在应用过程中各实验室还存在许多不同之处，例如对鸡胚的孵化时间各家报道不一，有人认为5日龄好，而有人则倾向于12日龄，笔者的体会是以7～9日龄接种最好。根据SchlaRer等研究结果，CAM血管生成大致经历了早期(5～7天)、中期(8～12天)和晚期(13～14天)3个阶段，早期CAM毛细血管虽然比较丰富和清晰，但抗外界环境变化的能力稍差，