蜕皮甾酮对氧化损伤人晶状体上皮细胞凋亡防护作用.docVIP

蜕皮甾酮对氧化损伤人晶状体上皮细胞凋亡防护作用(1.福建中医学院病理生理研究中心,福州 福建 350003; 2.福建中医学院附属第二人民医院眼科,福州 福建 350003) 收稿日期:2009-11-07 作者简介:黄秀榕(1948-),女,福建福州人,教授,博士研究生导师,主要从事白内障的基础与临床研究。 摘 要:目的:探讨蜕皮甾酮(ECR)对氧化损伤的人晶状体上皮细胞(HLEC-B3)凋亡有无抑制作用。方法:本研究在终浓度300μmol/L H2O2培养液中复制HLEC凋亡模型,并以雌二醇(E2)作为阳性对照,在透射电子显微镜下观察HLEC-B3超微结构的改变,采用FCM法检测HLEC-B3凋亡率及线粒体膜电位的变化。结果:超微结构研究显示,H2O2组绝大多数HLEC-B3发生凋亡,并呈凋亡各期改变的全过程;E2、ECR组仅少数HLEC-B3发生凋亡,并多为早期或中期的轻微改变。FCM结果显示:H2O2组HLEC凋亡率显著高于空白对照组;E2和ECR组凋亡率均低于H2O2组(P 本研究拟在复制人晶状体实验性氧化损伤模型的基础上,以E2为阳性对照,探讨中药植物雌激素ECR对氧化损伤的HLEC-B3的防治作用,为寻求防治白内障的确切有效的药物提供科学的实验依据。 1材料与方法 1.1主要仪器? 流式细胞仪(美国B-D FACScan)、电子显微镜(日立H-7650),超薄切片机(LaiCaUC-6) 、二氧化碳培养箱(美国FORMA 2111)、倒置相差显微镜(日本Olympus IMT-413)、超净工作台(江苏SW-CJ-IF)、微量移液器(法国GILSON)、冰箱(青岛BCD-268)、超低温冰箱(日本MDF-V5410)、微量电子天平(上海FA200X)、低速水平离心机(北京LD4-2)、恒温水浴锅(深圳HH-4)、干燥箱(上海101A-2)等。 1.2主要试剂? HLE-B3系中山大学惠赠的永生化人晶状体上皮细胞B3系,经复苏、传代培养所得。雌二醇粉末,纯度97%,美国Sigma公司产品;蜕皮甾酮(Ecdysterone, ECR)粉末,纯度96.3%,购自中国药品生物制品检定所;胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品,乙二胺四乙酸为美国Augus公司产品;DMEM培养基干粉为美国GIBCO公司产品,新生小牛血清为奥地利PAA公司产品,核糖核酸酶A、碘化丙啶和线粒体跨膜电位试剂Rhodamine123系美国Sigma公司产品。 1.3 HLE-B3复苏 培养及传代? 取出保存于液氮罐中的冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中,将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释,离心,除上清,反复洗涤3次。以5×105个/mL接种于培养瓶中,37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞生长融合后进行传代培养,弃去培养液,PBS液洗1次后,加入预暖的消化液1～2mL(含0.01% EDTA+0.25%胰蛋白酶),5～8min后倒置显微镜下观察,见细胞收缩、变圆后,立即加入含NCS的DMEM终止消化,用吸管轻轻吹打,使贴壁细胞脱落,制成细胞悬液。将细胞悬液离心(1500r/min,5min),去消化液,PBS洗1次,离心去上清,按1∶2分瓶传代。置于37℃、5% CO2培养箱中,2～3天细胞融合后继续传代培养。 1.4 分组与给药? 对照组:HLE-B3+含10%NCS的DMEM培养液;H2O2组:对照组+3×10-4mol/LH2O2;E2组:H2O2组+10-8mol/L E2;ECR组:H2O2组+ 10-7mol/LECR 1.5透射电子显微镜观察HLE-B3超微结构的变化? 按上述分组将H2O2以及E2、ECR分别与HLE-B3共同孵育24h后,收集细胞;将消化离心后的细胞以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液固定,4℃过夜,1%锇酸后固定,醋酸铀快染,乙醇-丙酮脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色;于透射电子显微镜75kv条件下观察HLE-B3超微结构变化,并摄影记录发生细胞凋亡的情况。 1.6 FCM法检测E2和ECR的凋亡率? 按上述分组将H2O2以及E2和ECR分别与HLE-B3共同孵育24h后,收集细胞;用PBS清洗离心两次,将预冷的70%乙醇沿壁缘滴入,轻轻吹打细胞,4℃固定12 h以上;离心(1500 r/min,5 min),去固定液,PBS清洗两次,弃上清;加入浓度为1mg/mL RNase A 30μL,37℃恒温水浴锅中孵育30 min;加入PI染色液800μL,4℃ 避光30 min;上机检测HLE-B3 的凋亡率,每次计数10000个细胞,所有资料经Modfit