血平板纸片法分离嗜血杆菌实验及评价.docVIP

血平板纸片法分离嗜血杆菌实验及评价材料和方法 材料：①菌株：流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49766、ATC49274，由卫生部生物制品检定所提供；临床分离2株流感嗜血杆菌，由卫生部临床试验中心提供；临床流感嗜血杆菌19株和其他嗜血杆菌51株，均由本院临床分离。②分离培养基：5%羊血肉液血琼脂平板(牛肉汤，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%琼脂和5%羊血，pH7.2)，VBC巧克力平板(制作方法参见文献[1])，普通肉汤巧克力平板(牛肉汤，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%琼脂消毒后，80℃时加5%羊血制成巧克力平板，pH 7.2)。 方法：①细菌鉴定：可疑菌落同时接种于血平板和M-H平板上进行卫星试验，补步鉴定流感嗜血杆菌和其他嗜血杆菌，用PAINH嗜血杆菌鉴定板(梅里埃公司产品)进行最终鉴定。②分离嗜血杆菌纸片的研制：通过观察比较各成分不同浓度对嗜血杆菌的影响，确定纸片含各种成分的最终浓度(含万古霉素45μg，杆菌肽300μg，辅酶1700μg和酵母粉150μg)。干燥后，30℃保存备用。对不同纸片的形状进行观察和比较后，发现长条状纸片优于圆形纸片。它可同时贴于划线平板的不同区域，即从原始划线处到分出单个菌落处，这样有利于提高嗜血杆菌的分离率，其最终大小为25mm×4mm。③纸片法分离各种嗜血杆菌的操作方法：将各种欲分离嗜血杆菌的标本，如痰、生殖系统拭子和脑脊液等标本，用常规方法接种于营养丰富的血平板上，将分离嗜血杆菌纸条一端贴于原始划线处，另一端贴向低浓度划线区(采用三区划线法时，纸条从一区向二、三区方向贴)放入CO?2培养箱中过夜培养，第2天观察结果，选择纸片周围生长而远离纸片不能生长的菌落。嗜血杆菌菌落多细小、透明、光滑，一些菌株较湿润，同时注意细菌的溶血情况。然后用血平板和M-H平板卫星试验进行初步鉴定。如果24小时观察难或细菌生长不良，需48小时后继续观察。④模拟阳性标本的配制：将上述流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49766、ATCC49274，临床分离的2株流感嗜血杆菌，分别制成0.5个麦氏管浓度的菌悬液，定量加入嗜血杆菌阴性痰标本中(痰标本经VBC巧克力平板培养鉴定为阴性)，制成流感嗜血杆菌不同浓度的模拟阳性标本。 纸条不同成分对嗜血杆菌生长的影响：制备3种纸条，纸条一含万古霉素45μg，杆菌肽300μg，辅酶粉150μg；纸条二含辅酶粉1700μg；纸条三含万古霉素45μg，杆菌肽300μg，酵母粉250μg。将流感嗜血杆菌同时接种血平板和M-H平板上，3种纸条分别贴在表面，37℃5%CO?2环境培养24小时，观察3种纸条周围流感嗜血杆菌生长情况。在血平板上，纸条一周围有非常小的抑菌环，在抑菌环外有大量流感嗜血杆菌生长环；纸条二周围有流感嗜血杆菌生长环；纸条三周围无流感嗜血杆菌生长。M-H平板上，3种纸条均无流感嗜血杆菌生长。 流感嗜血杆菌在3种培养方法上的生长情况比较：对传统的巧克力平板法、VBC巧克力平板法和自建的血平板纸片法流感嗜血杆菌生长情况进行观察。以其在传统的巧克力平板上每cm?2形成的菌落数为100%进行比较，观察单位内菌落数和菌落大小。其中传统的巧克力平板上单位菌落数为100%，菌落较大，约为1.5mm；VBC巧克力平板上单位菌落数为92.4%，菌落较传统巧克力平板的菌落略小，约1.2mm；在血平板纸片法上，其菌落的多少和大小均随纸片间的不同距离而变化，在菌落生长较好的区域，其单位菌落数为其95.6%，菌落大小约为1.2mm。 比较不同培养方法对模拟流感嗜血杆菌阳性痰标本的分离情况：用传统的巧克力平板法、VBC巧克力平板法、自建的平板纸片法和血平板上金葡菌划线法，对100株不同浓度的模拟流感嗜血杆菌阳性痰标本和50株嗜血杆菌阴性痰标本进行分离比较。 结 果 100株模拟阳性痰标本，4种方法的分离率分别为64%、76%、84%和28%。巧克力平板法与VBC巧克力平板法进行配对卡方检验，结果X?2=7.56，P0.01，其结果差异有显著性。巧克力平板法与血平板纸片法进行配对卡方检验结果X?2=16.3，P0.01，其结果要差异也有显著性。 临床痰标本分离嗜血杆菌比较：用VBC巧克力平板法和自建平板纸片法对我院呼吸内科患者162份痰标本同时配对进行分离培养，后对79份痰标本用自建的血平板纸片进行分离培养，其中VBC巧克力平板法分离痰标本162份，分离流感嗜血杆菌7株(分离率4.3%)，其他嗜血杆菌18株，血平板纸片法分离痰标本241份，分离流感嗜血杆菌12株(分离率4.98%)，其他嗜血杆菌33株。进行卡方检验后，其结果X?2= 0.9，P0.05，结果无差异。 讨 论 提高嗜血杆菌分离率是目前亟需解决的问题。由于各种原因，实验往往忽