裙带菜多糖3种脱蛋白质方法比较探究.docVIP

裙带菜多糖3种脱蛋白质方法比较探究摘要：目的筛选裙带菜多糖脱除蛋白质的最佳方法。方法采用Sevag法、三氯乙酸法和酶法对裙带菜多糖进行脱蛋白质处理，比较不同方法处理后多糖的脱蛋白质率及多糖损失率，确定最佳的除蛋白质方法。结果酶法的多糖损失率最低，为10.22％，脱蛋白质率最高，为61.10％；三氯乙酸法多糖损失率12.13％，脱蛋白质率57.37％；Sevag法多糖损失率14.21％，脱蛋白质率54.12％。结论酶法是裙带菜多糖脱蛋白质的最佳方法。 关键词：裙带菜多糖；脱蛋白质；酶法 中图分类号：Q946.3 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2010)03-0096-03 多糖是与人类生活紧密相关的一类生物高分子，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、降血脂、抗凝血等多种生物活性。近年研究表明，裙带菜多糖有显著的抗肿瘤作用。目前，国外(尤其是日本)对裙带菜的营养和药用价值的研究比较深入，国内的研究尚处于起步阶段。裙带菜作为安全经济的食品已广泛用于预防乳腺癌。 裙带菜粗多糖系用水提醇沉法从裙带菜(Undaria pinnatifida)孢子叶中提取，常含有一定量的蛋白质。因此，尽可能地去除粗多糖中的蛋白质并保留多糖十分重要。传统Sevag法和三氯乙酸法去除蛋白质通常需要重复数10次，费时，样品损失很大，而且需要处理废液。我们以脱蛋白质率和多糖损失率为指标，尝试用酶法去除蛋白质纯化裙带菜多糖。 1　材料 裙带菜(大连产)；木瓜蛋白质酶：岩藻多糖(天津一方科技公司)；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白质(南京建成生物工程研究所)；浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氯仿、正丁醇、三氯乙酸均为国产分析纯；低速离心机(北京医用离心机厂)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器公司)。 2　试验方法与结果 2.1　标准曲线的制备 2.1.1　糖标准曲线　称取干燥至恒重的岩藻多糖2 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解后稀释至刻度制成0.2 mg/mL贮备液。分别吸取贮备液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL用蒸馏水补至2.0 mL，然后向各管加入6％(w/v)苯酚试剂1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10min，振摇，室温放置15 min。以0为空白，在490 nm波长处测吸光度，以吸光度(A490mm)为纵坐标，岩藻多糖含量(μg)为横坐标绘制标准曲线。回归方程为：Y=0.001 2X+0.002 9，r=0.999 2，呈良好的线性关系。 2.1.2　蛋白质标准曲线　称取牛血清白蛋白质10mg，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解后稀释至刻度制成贮备液。量取考马斯亮蓝G-250溶液10mL加入40mL蒸馏水中混溶制成贮备液。分别吸取牛血清白蛋白质贮备液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL加蒸馏水补至1.0 mL，向各管中加入5 mL考马斯亮蓝G-250贮备液，混匀后室温静置5 min，以0为空白，在595nm波长处测吸光度，以吸光度(A595nm)为纵坐标，蛋白质含量(μg)为横坐标绘制标准曲线。回归方程为：Y=0.003 8X+0.005，r=0.999 4，呈良好的线性关系。 2.2　多糖的提取 取裙带菜干粉100 g与95％乙醇1：1混合，80℃水浴冷凝回流提取2 h，4层纱布过滤，滤渣干燥后，加.K50倍量蒸馏水90℃水浴5 h，4层纱布过滤后3 000r/min离心10min。滤液减压浓缩至一定体积加入95％乙醇至醇浓度为80％，静置过夜后过滤，用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，干燥得沉淀。将沉淀溶于适量水中得多糖溶液。 2.3　多糖溶液中多糖和蛋白质含量的测定 2.3.1　多糖含量　用苯酚-硫酸法，以岩藻多糖为对照品测定，多糖含量为55.42％。 2.3.2　蛋白质含量　考马斯亮蓝G-250法，以牛血清白蛋白质为标准品测定，蛋白质含量5.43％。 2.4　脱蛋白质 2.4.1　Sevag法　取裙带菜多糖5 g，配成饱和多糖水溶液，加入氯仿：正丁醇(5：1)，超声振荡20 min，混匀，3 000 r/min离心10 rain，除去水相与有机相间的蛋白质，水相仍按照此法反复除蛋白质至两相间没有白色蛋白质。氨水调pH 8-9，加双氧水过夜，透析，浓缩，4倍无水乙醇沉淀，丙酮洗涤干燥得多糖。将多糖溶于适量水中得脱蛋白质液1。 2.4.2　三氯乙酸法　称取裙带菜多糖5 g配成饱和多糖水溶液，以1：1等体积加入3％三氯乙酸溶液，静置2 h，离心取上清，按照此法反复除蛋白质至两相间没有白色蛋白质。经透析，浓缩，4倍无水乙醇沉淀，丙酮洗涤干燥得多糖。将多糖溶于适量水中得脱蛋白质液2。 2.