大肠杆菌表达重组蛋白的细胞冻融与超声破碎.docVIP

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一 可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2.? ?? ?方法2.1反复冻融??2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min??4℃离心15min，弃上清。2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为??。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2??超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间? ?。2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1） 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。（4）可通过SDS电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。二 包涵体蛋白的纯化1? ?? ???菌体的破碎 （加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机1.2 方法(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min??4℃离心15min，弃上清。（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。（6） 4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2 包涵体的洗涤(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml洗涤液。(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。BufferA 50mM??Tris-HCl??pH 8, ??0.2mM??EDTA, ??100mM??NaCl, ??1%??Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠） ??1mM? ? DTT ??1mM? ? PMSF 溶菌酶 10mg/ml ? ?? ?? ?? ? 注意事项：(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。(3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经