人工免疫原制备.doc

人工免疫原制备 人工免疫原的制备.txt6宽容润滑了彼此的关系，消除了彼此的隔阂，扫清了彼此的顾忌，增进了彼此的了解。 点击次数：203 发布时间：2010-7-18 15:07:27 半抗原是指本身无免疫原性，只具有反应原性的物质。半抗原物质多数为低分子量的化学，例如多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药物(包括抗生素)以及其他化学物品等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后，才具有免疫原性，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。这种经过人工修饰的半抗原称之为人工抗原，用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。 一、常用的载体 1、蛋白质类 蛋白质是一类结构复杂的胶体两性化合物，是一种常用的良好载体。其中以白蛋白最为普遍，这是由于白蛋白具有较高的溶解度，免疫原性强，取材方便。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，以牛血清白蛋白最为常用。 2、多肽聚合物 多肽聚合物是人工合成的。常见的有多聚赖氨酸，分子量可达十几万到几十万，是良好的载体。这种多聚物和半抗原结合后，可刺激动物产生高滴度、高亲和力的抗体。多聚赖氨酸可和半抗原的-NH2或-COOH结合。 3、大分子聚合物 包括羧甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等。大分子聚合物皆可和半抗原结合，加入弗氏佐剂可诱导动物产生高效价的抗体。 二、选择载体时应考虑以下因素 1、带有正电荷的碱性蛋白往往是好的免疫源 2、大分子聚合物必须经体内酶解后才能诱发反应，不能被分解者如碱性消旋蛋白，阿拉伯胶、D-氨基酸聚合物等不能用做载体 3、当半抗原接在载体上引起蛋白质结构发生明显改变时，才能诱发半抗原抗体。小分子物质和蛋白质之间以桥(space bridge)的形式连接。Marks认为，4个碳(C)的桥是最合适的C链 4、载体免疫源性的强弱和产生半抗原抗体的水平有关，但并不是绝对的 5、半抗原和载体蛋白的分子比很重要，一般认为两者的比为10～20∶1最好 三、半抗原和载体连接时，应选择合适的方法，结合方式的选择应考虑如下因素 1、半抗原的溶解度和稳定性 在结合反应中应不导致半抗原活性的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。 2、结合键的位置 抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3、选择适合的偶联试剂 不同的半抗原在偶联时，应根据半抗原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结构的稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质和偶联剂接触后，使不同蛋白质分子的功能基团交联并凝聚。广泛交联的蛋白质，其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。 四、连接方法 半抗原和载体的连接通常可用物理和化学方法进行。物理吸附的载体有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，它们借电荷和微孔吸附半抗原。化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上，这些载体包括血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚赖氨酸。带有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原，可直接和载体连接。其他不带有氨基或羧基的半抗原，须加以适当的改造，使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，才能和载体连接。 1、有游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原和载体的连接方法 (1)碳化二亚胺法 碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可和半抗原上的羧基又可和半抗原上的氨基缩合。 此法非常简便，只要将半抗原和载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。 (2)戊二醛法 戍二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基和载体和半抗原的氨基以共价键连接。 (3)混和酸酐法 混合酸酐法又称为氯甲基异丁酯法，主要用以甾体激素和蛋白质的偶连。以烷基氯甲基为偶连剂，最常用的是氯甲基异丁酯。含有羧基的半抗原和氯甲基异丁酯反应形成混合酸酐，然后在和蛋白质载体上的氨基反应形成肽键。 (4)过碘酸氧化法 过碘酸将糖环氧化成双醛基，再和蛋白质上的氨基偶联。本法常用于配糖体类药物和蛋白质的偶联。 2、带有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法进行连接 (1)琥珀酸酐法 本法用于带有羟基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。 (2)羧甲基羟胺法 带有酮基的半抗原(如孕酮、睾酮)和O-(羧甲基)羟胺反应，转变为带有羧基的半抗原衍生物。 (3)重氮化的对氨基苯甲酸法 本法适于带有酚基的半抗原(如某些药物)的改造。先将对氨基苯甲