分子生物学5 分子生物学研究方法(上)——DNA RNA 蛋白质操作技术.doc

第五章 分子生物学研究方法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 重点：1. DNA操作技术 2. 基因克隆的主要载体系统 难点：1. DNA操作技术 2. 基因克隆的主要载体系统 课时分配：8学时 第一节 重组DNA技术史上话 一、二十世纪分子生物学的三大成就 （1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； （2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复制和世代交替问题； （3） 50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 二、基因工程 1、基因操作 gene manipulation 主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 2、基因工程 genetic engineering 将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。 3 工具 基因的剪刀——限制性内切酶 基因的针线——DNA连接酶 基因的运输工具——载体 4 基本步骤 提取目的基因 目的基因与载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达 三、DNA 重组技术 recombinant DNA technique 其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。 四、重组DNA技术史上的主要事件 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 五、生物技术工程： 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程 第二节 DNA操作技术 一、DNA的分离，提取 1. 材料的选择：物种、组织的选择 2. 组织匀浆：细胞分散、破碎(EDTA:乙二胺四乙酸；Tris-Hcl: 三羟甲基氨基甲烷 3. 破碎细胞： SDS表面活性剂 4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提 5. 除RNA： RNA酶 6. DNA回收： 乙醇、异丙醇沉淀 7. 质量鉴定： （1） 琼脂糖凝胶电泳，常用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下观察和照相。 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性内切酶作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。 原理： 带有电荷的分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，在无反应活性的稳定的支持介质中，与分子的摩擦系数成反比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数越多，分子越小，其迁移的速度越快，反之越慢。因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所携带的净电荷数的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分分离开来。 核酸带负电荷，放置在电场中，会向正极方向迁移。相同碱基数量的双链DNA分子几乎带有等量的净电荷，能以同样的速度向正极方向迁移。在一定电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子大小和构型，可以通过电泳将核酸分子混合物中大小不同的片段分离开来。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海澡产物琼脂中提取出来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。 B.检测量：可达ug，ng级 C.检测信息：DNA的有无、 DNA的大小、 构象、 纯度 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用二甲苯青（F.F）染色，白光灯观察和照相 （3）两种方法比较 ① 凝胶的分辨能力同凝胶的浓度和类型有关。