检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应-浙江大学学报.PDF

浙江大学学报（农业与生命科学版） 43（2）：153～162，2017 JournalofZhejiangUniversity(Agric.LifeSci.) /agr E-mail:zdxbnsb＠ DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2016.04.191 检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立 高灿灿，刘佳玫，栗军杰，陆兆新，吕凤霞，张充，赵海珍，别小妹*1 （南京农业大学食品科学技术学院，南京210095） 摘要 以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌（Exiguobacteriumacetylicum）为研究对象，建立定量检测E.acetylicum的双重 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction,RT-PCR）方法。以前期试验发掘到的微小杆菌 （Exiguobacteriumsp.）的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi检测靶点，对其 设计特异性探针，并对反应体系进行优化，以12株E.acetylicum为阳性对照，以4株微小杆菌属内其他种的菌株以 及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照，对建立的RT-PCR进行特异性检测；通过标准曲线的制备、灵敏 度、可重复性来评价该方法的有效性。最后，应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行 2 检测。结果表明：本研究设计的探针特异性良好；检测靶点P401_RS0117025与oxi标准曲线的R 值分 －7 别为0.994和0.999，且重复性好；该方法的DNA检测限为1.629×10 ng/μL，纯菌菌落检测限为3.4CFU/mL，并能对 鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外，还建立了“C （阈值）-N（菌体浓度）”的数量关系，能对供试样品t t 中的E.acetylicum进行绝对定量。总之，本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR 定量方法，为食品货架期预测提供了理论依据。 关键词 乙酰微小杆菌；双重实时荧光定量聚合酶链式反应；TaqMan探针 中图分类号 Q-31 文献标志码 A IdentificationofExiguobacteriumacetylicum byadoublereal-timepolymerasechainreactionassay. JournalofZhejiangUniversity(Agric.LifeSci.),2017,43(2):153-162 * GAOCancan,LIUJiamei,LIJunjie,LUZhaoxin,LÜFengxia,ZHANGChong,ZHAOHaizhen,BIEXiaomei （CollegeofFood ScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China） Summary Exiguobacterium sp.hasbeenfiguredouttobethemainspoilagebacteriaonmanykindsoffood,andithasthe potentialtobethemainspoiler.BacteriaExiguobacterium havealreadybeenisolatedf