- 1、本文档共7页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
MTT实验操作步骤的
MTT的操作方法
一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。二、MTT法用来做什么
?简单地说:是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途
1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;
2.细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。
四、实验所需材料
1.MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g
1.1对于100mg这样的小包装,厂家都是将MTT放入小管中的,个人建议不要再用天平称量分装,而应该一次性将其全配制成溶液,如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法:预先在50ml离心管(没有的话,可用培养瓶替代)加入20ml PBS,从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中,吹打若干次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。可以重复几次,以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算,一般每96孔板约需1ml,所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2对于大包装,可按上述方法称取一部分溶解,也有人将粉剂分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加。
注意事项:
l在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
l配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感
lMTT一般最好现用现配,过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液,效果仍然不错)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
lMTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.
2.MTT甲瓒溶解液
2.1二甲基亚砜DMSO,可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。
2.2三联溶解液:SDS10g,异丁醇5ml,10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液(文献方法:周建军等,评价抗癌物质活性的改良MTT方法,中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457),该溶解液不需去除原培养基,但溶解较慢。(个人觉得其溶解的能力不如DMSO强)
该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。
对于初学者而言,要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手,我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的25cm2为例,
1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态),消化离心收集后,将上清去掉,加入3ml培养基使其混匀。
2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用),装入约9ml培养基.
3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管,混匀后细胞计数,此时一般为或小于5-10×104/ml,该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度,再根据计数的结果滴加细胞悬液,每滴按50ul计算。
)细胞数量因实验目的不同应做相应调整,如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml),细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。
2.将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入1
文档评论(0)