3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用.pdfVIP

中国畜牧兽医 2015 ,42 (1) :002牛0031 China Animal Husbandry Veterinary Medicine doi: 10. 16431/j. cnki.1671-7236. 2015. 01. 004 3 种猪细胞因子 mRNA 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立与应用 王风雪l ，黄双2 ，刘 莹1 ，杨勇1 ，孙娜1 ，朱洪伟1 ，张淑琴l ，程世鹏1 ，温永俊h (1.中国农业科学院特产研究所，特种经济动物分子生物学国家重点实验室，长春 130112; 2. 沈阳农业大学，沈阳 110866) 摘 要:为建立猪细胞因子 SYBR Green 1 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法，根据 GenBank 中 3 种重要的猪细胞 因子即猪自细胞介素 2 (interleukin-2. IL-2) 、 α 干扰素(interferon a , IFN-a) 和肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis fac tor ,TNF-a) 的基因序列，设计特异引物扩增目的基因。将 3 种基因克隆至 pMD18-T 载体上，得到各自阳性克隆质 粒，以 3 种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明，当 标准品稀释度为 1 X 10 ~ 1 X 106 时， 3 种基因的 Ct 值与浓度间具有良好的线性关系，相关系数均》 拷贝/μL 0.992 。熔解曲线分析表明，产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSVTJM-F92 株免疫的 30 日龄猪外周血单核细胞(PBMC) 中 IL-12 、 IFNα 和 TNFα 表达量进行检测.结果 发现，免疫了 PRRSV TJM于92 株的猪 PBMC 细胞内 3 种细胞因子表达量均极显著升高(PO.01) 。研究结果为 IL-12 、 IFNα 和 TNF-α 的定量分析提供了技术平台。 关键词:猪;细胞因子;SYBR Green 1 ;实时荧光定量 RT-PCR 中图分类号:S828 文献标志码:A 文章编号: 1671-7236(2015)01-0024-08 Establishment and Application of Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method of the Detection of Three Swine Cytokines 1 1 1 WANG Feng-xue , HUANG Shuani , LIU Ying , YANG Yong , SUN Na , ZHU Hong-weP , 侵 1 1 ZHANG Shu-qin , CHENG Shi-peng , WEN Yong-jun (1. State Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals , Institute of Sρecial Wild Economic