PK-15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用.pdfVIP

Vo l. 34 No.4 第 34 卷第 4 期 家畜生态学报 2013 年 4 月 Acta Ecologiae Animalis Domastici Apr.2013 PK-15 细胞 α 干扰素效应因子 qPCR 检测方法的建立及其初步应用 邹榕凯l ，李俊2 ，时建立2 ，柳晓1 ， 2 ，丛晓燕2 ，孙文博2 ， 杜以军2 ，吴家强2 ，王金宝1，2 椅 (1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109; 2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所.山东济南 250100) [摘 要] 为建立一种用 SYBR Green I 荧光染料检测 PK-15 细胞 α 干扰素(α-IFN) 效应因 子 Mx1 、 OAS 的 mRNA 表达水平的 qPCR 检测方法，通过在猪圆环病毒 2 型 (Porcine Circo- virus Type 2 , PCV2)抑制 α-IFN 发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据 GenBank 中目 的基因的序列，利用分子生物学软件 Premier 5. 。在其保守区设计并合成相应的特异性引物。 利用 TRIzol 法提取总 RNA，经 Oligo d(T) 15 进行反转录，利用 PCR 扩增各段目的基因，并 克隆至 pMD 18-T 载体，转化大肠杆菌 DH 5a ， 经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立 SYBR Green 1 qPCR 标准曲线和溶解曲线，并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立 的实时 qPCR 方法，检测 PCV2 对 α-IFN 效应因子的抑制效果。对建立的 PK-15 细胞 αIFN 效应因子 SYBR Green 1 qPCR 方法进行分析，结果表明 Mx1 、 OAS 和内参 ß-actin 基因的 Ct 值与标准品稀释度在 1 X 101 -1 X 108 copies/μL 的范围分别呈良好的线性关系。 PK-15 细胞 在接种 PCV2 ，并受到 a-IFN 剌激后 Mxl 、 OAS 的相对表达量较未接种 PCV2 明显降低。本 试验建立了 PK-15 细胞 α-IFN 效应因子的 qPCR 检测方法，为在 mRNA 水平上对 PK-15 细 胞 α-IFN 效应因子的定量分析奠定了基础，并成功地初步应用于 PCV2 抑制 a-IFN 发挥效应 的信号通路研究中。 C关键词] qPCR; SYBR Green 1; 猪圈环病毒2 型 ;PK-15 细胞;α-干扰素 [申图分类号] S8 11. 6 [文献标识码] A [文章编号] 1005-5228(2013)04-0019-06 细胞因子(cytokine ， CK) 是一类能在细胞间传 并激活 ISGs (Interferon-stimuLated genes) ，产生 递信息，具有免疫调节效应的功能蛋白质或小分子 OAS(2习-oligoadenylate synthetase) 和 Mx(Myxo­ 多肤。细胞因子作为细胞间信号分子在机体的细胞 virus resistance) 。通过这些酶发挥抗病毒活性，从 而使细胞建立抗病毒状态[2J 。 与体液免疫中发挥着重要的作用。作为机体重要的 细胞因子，干扰素(Interferon ， IFN) 自 1957 年被英 目前细胞因子表达量的检测主要是通过相关蛋 国学者发现以来，一直是细胞因子研究中比较活跃 白