基于DNA序列的相关技术.pptxVIP

一、PCR原理与操作 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家Dr. Mullis发明，由于在理论和应用上的跨时代意义，1993年H获化学诺贝尔奖。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 基于变性与复性原理的PCR技术 PCR原理： 由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片段进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的2的n次方，使得宏观检测扩增产物中的特定基因成为可能。 (c) (b) 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 引物2互补链 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) PCR操作 反应体系: 耐高温的聚合酶-Taq聚合酶：由栖热水生杆菌中提纯的天然酶或基因工程酶。能够耐受高温，保持较强的聚合活性。 保持酶活性的反应缓冲液（buffer) DNA合成的原料：dNTP(与ddNTP异同) DNA复制的模板：样品DNA,防止交叉污染（采样过程中和提取及处理过程中） 引物：上下游引物 标准的PCR反应体系： 　　　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　100ul一般为25ul体系 PCR引物设计的原则 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部的二级结构和两条引物间互补，特别是3‘端互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 （引物设计软件：DNAMAN,Lasergene等) 引物序列设计与分析 引物设计： Primer 3 (Whitehead Institute, MIT) /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi GeneFisher (Bielefeld University) http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUPqid=nasample=dna Fast PCR (Biocenter, University of Helsinki) http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm PerlPrimer (Owen Marshall) / Primer Design Assistant (Division of Biostatistics and Bioinformatics, National Health Research Institutes) .tw/primer/ 反转录 (RT) PCR 引物设计 ExonPrimer (Technische Universität, München) http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html AutoPrimer (Deutsches Krebsforschungszentrum) http://www.autoprime.de/ 引物特异性的验证 Blast (NCBI) /BLAST/ 引物/探针特性的评估 OligoAnalyzer (IDT) /Analyzer/ Oligo Analysis Plotting Tool (Operon/Qiagen) /oligos/toolkit.php NetPrimer (Premier Biosoft) /netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html Gene Walker (Cybergene) http://www.cyberge