第三章__细胞生物学研究方法.ppt

本章习题 名词解释 原位杂交 细胞培养 单克隆抗体 激光扫描共焦显微镜 问答题 设计一套分离细胞核、叶绿体、线粒体的技术路线。 电子显微镜与光学显微镜的结构原理有何主要异同点 放射自显影技术的基本原理及其用途。 阐明光学显微镜的成象原理。显微镜的分辨力有何意义？ 免疫荧光技术的原理和操作步骤如何？试与放射自显影技术相比较。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 83 正常 近视 远视 * R的值越小则分辨能力越强 * Condenser lens 聚光镜 兰木达是入射光波长 标本对聚光镜的张角 n是折射率最高1.5 * 2个滤光镜和1个二色镜 * 相位相同，经过干涉振幅变大，光强，反之相位不同，经过干涉振幅变小，光弱 经过标本以后 折射光比偏折光超前了四分之一个周期 相位板使直射光或超前或片滞后了四分之一个光程差 * * 肌动蛋白纤维观察图 * 蔗糖密度梯度作用，稳定沉淀成分，防止对流混合 * 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 52 差速离心（different centrifugation）： 用于分离大小、形状不同显著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离，将各种亚细胞组分和颗粒分次沉淀的分离技术。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 53 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 54 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体、病毒等。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 55 等密度离心法： 按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 56 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的 显示方法 原理：为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检物质中的一些特殊集团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 57 福尔根（Feulgen）反应可以特异显示DNA的分布：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露的醛基与希夫试剂反应呈紫红色。 PAS反应（过碘酸雪夫反应）则可确定多糖的存在 四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在 苏丹Ⅲ（深红色）通过扩散进入脂滴中，使脂肪滴着色 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 58 在米伦（Millon）反应中，氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀 Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应） 茚三酮反应：显示蛋白质 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 59 Schiff反应 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 60 三、特异蛋白抗原的定性与定位 免疫荧光和免疫电镜技术是最常见的研究 细胞内蛋白质分子定位的重要技术。 甘肃农业大学 细胞生物学第三章 61 免疫荧光技术 概念：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 例如：将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微