基因工程酵母单杂交技术的原理及应用.docVIP

酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。 将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。 编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。 转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。 优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。 缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。 如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。 酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。 Chew et al （1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。 2. 对DNA结合结构域进行分析 如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析. Mak et al （1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。 酵母单杂交方法(Y east One2hybrid method)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA 顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因(cDNA)。该方法也是在细胞内( invivo)分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图1所示 ,将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子 (minimal promoter , Pmin) 上游 ,Pmin启动子下游连接报道基因。进行cDNA融合表达文库筛选时 ,编码目的转录因子的 cDNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后 ,其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合 ,就可以激活 Pmin 启动子 ,并促使报道基因表达。根据报道基因的表达 ,筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 限制哺乳动物神经元钠通道基因表达的一种沉默子蛋白 REST[3 ],与胡萝卜 Dc3 基因启动子 ABA 诱导和胚特异性表达相关的顺式元件相互作用的一族新的 bZIP转录因子[4 ],都是应用酵母单杂交方法获得 1 　cDNA AD 融合表达文库的构建。。应用酵母单杂交方法筛选编码特定转录因子的合适cDNA ,首先要构建 cDNA AD 融合表达文库。AD 是激活区的简写 ,一般常用 G AL4 因子。对于某些正常情况下不表达的基因 ,必须经过一些特定处理诱导其表达 ,才有可能克隆到它们所编码的转录因子。将分离提纯的mRNA合成cDNA ,两端接上带有合适酶切位点的连接物,构建到融合表达载体中 G AL4 AD 下游的多克隆位点。然后 ,进行噬菌体包装，在 X L-1 细胞内进行自动剪接环化,最后提取 cDNA质粒用于筛选。 2 　 酵母报道子的构建。。这是用酵母单杂交方法克隆特定转录因子中的一个重要内容。将已知的特定顺式元件的重复序列 ,按同一方向串联连接起来 ,构建到接有报道基因的最基本启动子(Pmin)上游 ,再将重组表达载体转化到酵母基因组中。通过报道基因的作用 ,在选择培养基上获得含有 “-顺式元件-Pmin -报道基因-”的酵母转化子。 3 　 cDNA融合表达文库的筛选。。。在构建文库时 ,cDNA是随机插入 AD 融合表达载体 ,即编码目的蛋白的cDNA片段可能正方向或反方向插入进去。利用含有pHISi-1 和pLacZi 双重报道子的酵母转化子来筛选 cDNA AD 融合表达文库。 4 　 阳性克隆的鉴定。。通常采用 3AT抗性检测与半乳糖苷酶活性检测两种方法来鉴定阳性克隆。取上述获得的阳性克隆菌落 ,充分悬浮于 200 μl TE 溶液 ,涂布于含 60m