1图位克隆.ppt

利用T-DNA突变体分离克隆基因 侧翼序列（Flanked-sequence tag, FST）的分离方法 热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR） 反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 质粒拯救（Plasmid rescue） 接头PCR （Adaptor PCR） TAIL-PCR AD primer：任意简并引物 （Arbitrary Degenerate Primer） 反向PCR 质粒拯救 接头PCR 基因同源性分析 保守序列 简并引物 PCR获得基因片段 或是RT-PCR获得cDNA片段 RACE法获取全长 cDNA片段做探针，从cDNA文库钓取全长 3. 同源序列法 PCR 巢式PCR 多重PCR 反向PCR Touchdown PCR 4. mRNA差异比较为基础的分离法 Mutant and wild-type 表型差异： 不同基因型目标基因在细胞总DNA中所占比例很小。mRNA仅代表那些在基因组中能够表达的基因顺序。 同一材料不同时空背景、不同环境响应下mRNA表达可能不同 4. mRNA差异比较为基础的分离法 差异显示(mRNA differential display) DDRT-PCR (difference display RT-PCR) 差减杂交Subtractive　Hybridization 代表性差异分析（Representational Difference Analysis，RDA ） 抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization， SSH 竞争性杂交（ Competitive Hybridization） Reverse Transcription PCR Amplification Denaturing Polyacrylamide Gel CAAAAAAAAAAAA-An TAAAAAAAAAAAA-An GAAAAAAAAAAAA-An 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs MMLV reverse transcriptase CAAAAAAAAAAA-An GTTTTTTTTTTTCGAA 5’-GCTTGATGCC-3’(H-AP-1 Primer) 5’-CTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs a-[33P-dATP] Taq DAN polymerase GCTTGATGCC GTTTTTTTTTTTCGAA X Y Differential Display ①3’端有12种组合锚定引物 ②10核苷酸引导第2链合成 ③两引物扩增产物差异 Subtractive Hybridization Samples of Interest mRNA Extraction Reverse transcription Hybridization cDNA RNA cDNA cDNA RNA RNA ①生物素标记 ； ②cDNA与RNA复合体 抑制消减杂交 Suppression Subtractive Hybridization (SSH) 2次PCR 1st接头外侧（5‘）作引物； 2nd：接头内侧（3‘）作引物 应用的几个关键点： ①tester与driver配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系密切．从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。 ②在选用限制酶时应尽量选用对于基因组DNA中酶切位点较少的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大—些。例如使用Rsa I可产生600 bp左右的片段，这样既可防止过长的cDNA片段影响杂交效率，也可提高每个基因的代表性。 ③接头的设计上。接头要含有酶切仿点以连于平端cDNA上，重要的是要在其末端含有一段反向重复序列，这使得在PCR反应中能选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA片段的扩增，即抑制PCR技术。 优点： 特异性强 假阳性率低 高敏感性，检出低丰度mRNA 速度快，效率高 缺点 mRNA用量高 得到的是cDNA片段 研究材料之间不能差异太大 * 转基因用，分子机理研究 * 在已知基因组序列的基础上可以不构建物理图谱。仅仅进行精细定位，最后用PCR的方法克隆基因。 * 水稻 1cM=270kb, 人类 1cM=1000kb * RIL: recombinant inbrid line. DH: doubled haploid NIL: near isogenic line PAC 载体以F 因子和噬菌体P1 为基础构建,兼