一种用于治疗银屑病含中药茜草根外用制剂的研发.doc

利用實驗方法確定茜草根為抗銀屑病之有效中藥 82級醫療 林志秀 摘要 本課題運用實驗方法篩選常用治療銀屑病之中藥, 發現茜草根具有很強的抗表皮細胞增殖之作用, 而誘導細胞凋亡乃其作用機理。 實驗結果還表明茜草根具有抗炎及促進表皮細胞分化的生物活性, 因而是一種具較佳抗銀屑病活性之中藥, 值得在皮膚科臨床上推廣應用。 引言 銀屑病(Psoriasis) 是一種常見的因機體免疫功能異常引起的慢性炎症性皮膚病。銀屑病在不同人種中的發病率由0.5%至2.5%不等, 據近年的流行病學調查,我國的發病率約為0.5%。根據其皮膚損害的不同表現, 臨床上將銀屑病分為尋常型、點滴型、紅皮病型和關節型等幾種。組織病理學方面,銀屑病皮損的典型改變為表皮細胞過度增生(Hyperproliferation),表皮細胞分化不全(Aberrant Differentiation)和真皮血管增生 (Neoangiogenesis)。一般認為,改變這些組織病理學的異常將會改善本病的臨床症狀。 課題目的 具不完全統計,全球每年用於治療銀屑病的總費用高達三十億美元以上。目前用於治療銀屑病的西藥主要有類固醇、維生素D衍生物、蒽林、免疫抑制劑和近年用以臨床的生物製劑等。但這些藥物存在明顯的局限性，包括短期療效欠佳, 長期使用常常產生耐藥性, 副作用如皮膚刺激，燒灼感，瘙癢感較為普遍以及增加肝腎毒性和患皮膚癌的風險等等。由於現存西藥的種種缺點和毒副作用,很多銀屑病病人常常選擇另類和補充醫學作為治療手段。而作為補充醫學重要組成部分的中醫藥,其用於治療銀屑病具有悠久歷史，例如隋代的諸病源候論已對銀屑病的發病原因和臨床表現作了詳細的描述,此後歷代醫家對本病的治療創制了不少行之有效的治療方法和中藥方劑。據筆者課題組對古代和近代治療銀屑病所選用之中藥進行初步的綜述,發現常用在治療銀屑病方劑中之中藥有60餘種之多。由於中藥治病大多是以復方的形式為主, 具體哪味藥物是方中的有效成份則難以確定,致使臨床中藥的運用有一定的盲目性。因此,發現和確定治療銀屑病的有效中藥具有重要的臨床意義。本課題旨在從治療銀屑病之常用中藥中篩選有效的抗銀屑病藥物，為臨床用藥提供科學證據, 並為將來臨床試驗打下基礎。 藥物的選取和篩選 根據傳統中醫臨床用藥經驗，我們選取了60種治療銀屑病的常用中藥，範圍包括清熱解毒類, 血涼血化瘀類, 祛風除濕類, 健脾益氣類及外用類中藥。首先我們用80%乙醇對所選取的中藥進行提取，利用旋轉蒸發儀回收乙醇,得到乾燥的中藥提取物。隨後進行細胞培養的體外試驗，用SRB 和 MTT 法估算細胞數目,繪製細胞生長曲線, 獲得抑制50%細胞生長所需藥物濃度(IC50)來評估它們抗表皮細胞HaCaT株增殖作用, 從而測試這些提取物抑制表皮細胞增殖分裂的活性。我們的篩選結果表明，在所選取的60種中藥中,茜草根(Radix Rubiae)和雄黃(Realgar)具有非常明顯的抗表皮細胞增殖的能力, 其IC50值分別為1.4和6.6 (g/ml, 而陽性對照藥物蒽林(Dithranol)的IC50則為0.33 (g/ml。這些實驗結果表明中藥茜草根提取物具有十分強的抗表皮細胞增殖的生物活性, 其活性強度與蒽林相若[1]。 茜草根可引起表皮細胞凋亡 細胞壞死和細胞凋亡是引致抗細胞增殖現象的主要機理。為了闡明細胞凋亡是否為引起抑制表皮細胞生長的機理,我們隨後進行了DNA瓊脂凝膠電泳，PI標記細胞凋亡檢測法，Annexin V-PI 雙標記細胞凋亡檢測法，活化Caspase-3免疫組織化學等試驗，結果證實茜草根提取物主要是通過誘導細胞凋亡來實現抑制表皮細胞增殖的作用[2]。償若茜草根所致的抗細胞增殖現象是由細胞壞死引起,則其運用于銀屑病人身上將會不可避免地引起強烈的炎症反應,這將大大削弱茜草根作為臨床用藥的可行性。而茜草根所具有的誘導表皮細胞凋亡作用則不會導致炎症反應,因而其具有良好的抗銀屑病活性。 茜草根的抗炎作用 由於銀屑病是一種與炎症密切有關的皮膚病，治療銀屑病理想的藥物須具有抗炎的效果，我們隨後進行茜草根的抗炎作用的體外實驗,結果顯示中藥茜草根的乙醇提取物能顯著地抑制由PHA刺激所引起的外周血單核細胞(PBMC)的過度增殖，而對靜態下PBMC 卻只有較微弱的細胞毒性。另外，茜草根對外周血單核細胞中與機體炎症反應有關的細胞因數如幹擾素?，腫瘤壞死因子α等的生成具有明顯的抑制作用, 初步表明茜草根具有較好的抗炎生物活性。 茜草根的萃取提純 為了進一步提高茜草根提取物的生物活性，本課題運用植物化學的方法, 進一步對其進行萃取提純，分別得到己烷, 乙酸乙酯, 正丁醇和水溶性四種萃取物，並對其抗表皮細胞HaCaT株增殖的強度作出檢測,結果見下表: 茜草根萃