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基因定点突变技术描述
基因定点突变step by step
本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术,其它较长片段的突变,删除,插入技术以后会慢慢奉上:在做实验之前,我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做:第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧,Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性差,其错配机率是比较高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果是2000bp的基因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了。第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者改造成不同的亚型,总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要,相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。对于第一种情况:我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置,如果不是很重要,大可不必管它,比如说是三联密码子的最后一位,碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变,那么一般情况下也可以不去理它。另外,在NCBI上人类的基因的版本一直在变化,也就是说同一个基因有不同的版本,或者称不同的亚型,其碱基序列有些许的差异,只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配,一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱,那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了,不过最好换个保真性好一点的酶如PFU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于第二种情况:这种情况下一般也就只能做定点突变了。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧,那个Stratagene试剂盒!上面有一个说明书,说得好像很正规,不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话,看都不看,我们简明扼要地只讲实验方面,通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了:第一:引物怎么设计呢?第二:模板怎么去掉呢?第三:怎么拿到质粒呢?对于第一个问题:怎么设计引物?我只能讲一些原则,并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲,这里就不重复了:不过这种突变引物要加上一个原则:一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12basepair。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,大家应该都知道,引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个base pair,并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚,那我就举个例子吧:X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960现有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924*********************************************** ************|------deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984************************************************************(上面为目的序列,下面为现有序列:我们发现有一个A碱基的缺失,其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配)我们以它为中心设计引物:两边各至少12个碱基,左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低,故拉长引物使GC%含量不至过低,也使引物退火温度升高。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG其实也不一定要反向互补序列,只要反向引物也是两边都有大于12个碱基,
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