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Small RNA 测序分析与研究/2012/07/25/2789.html2012年07月25日???Reviews??共 3636字??暂无评论??被围观 153 views+small RNA是生物体内一类重要的功能分子，包括microRNA. siRNA和piRNA。它的主要功能是诱导基因沉默，调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物学过程。基于新一代高通量测序技术的small RNA测序，可一次性获得数百万条small RNA序列，能够快速地鉴定某种组织在特定状态下的所有已知small RNA并发现新的small RNA，为small RNA功能研究提供有力工具。一、研究内容1.测序和基本数据处理对总RNA(或small RNA)样品进行检测，检测合格后进行small RNA样品制备，经过下A克隆检测合格之后上机测序。基本数据处理包括：图象识别、碱基识别、过滤接头序列和污染序列、去除低质量序列。2.高级生物信息分析内容small RNA长度的分布统计;将small RNA定位到基因组，探索其在全基因组的分布特征;两个样本的公共序列和特有序列分析;与microRNA数据库(miRBase 14.0)进行比对，鉴定已知microRNA;通过与Rfam 9.1数据库以及GenBank数据库比对，鉴定rRNA、tRNA、snRNA等降解片段;鉴定与重复序列相关的small RNA;鉴定mRNA降解片段;small RNA分类注释;预测新的microRNA;单个样本的microRNA表达模式分析;两个样本的microRNA差异表达分析;microRNA的表达模式聚类分析;MicroRNA靶基因预测。二、技术路线图1：small RNA测序分析的实验流程三、技术特点高通量：一次测序得到300万条以上的序列;不依赖已知信息：既能鉴定已知microRNA，又能发现新的microRNA;高分辨率：可以检测microRNA单个碱基的差异;高精确度：精确计数表达量为几个到数十万个拷贝的small RN氏重复性好：深度测序保证了抽样随机性，可靠性高，不需重复实验。四、研究案例取某动物组织，提取其20 ug总RNA，进行样品制备和新一代高通量测序。1. small RNA长度分布统计对获得序列的分子长度和数量进行统计分析，结果显示出该动物small RNA的特征分布，大量分子长度集中在22 nt附近(图2)。长度分布统计可用于验证实验的可靠性。图2：small RNA序列长度分布统计2. microRNA碱基偏好性鉴定microRNA的5’端第一个碱基对U有很强的偏好性，对G则有抗性;第二到第四个碱基缺乏比其他位置碱基通常缺乏C(第四个碱基有时例外)。统计microRNA碱基使用偏好是检验数据质量的依据(图3)。图3：已知microRNA的碱基使用偏好3.与数据库进行比对注释small RNA将得到的序列分别与miRBase数据库、mRNA/EST数据库、rRNAetc等数据库进行序列比对，鉴定出已知的microRNA(图4)。图4：microRNA及其它不同种类的RNA分子所占比例统计4.鉴定与重复序列相关的small RNA研究发现，部分small RNA来源于高重复区域或转座子区，它们会与不同的Argonaute蛋白结合并且参与一些重要的生物学过程，例如DNA甲基化和转座子的调控。这些small RNA被称作重复序列相关的small RNA (repeat-associated small RNAs)。根据结合的Argonaute蛋白不同，它们可以被细分为不同的类型 (图5)。图5：样品中重复序列相关的small RNA的分布情况5.预测新的microRNAMicroRNA前体的标志性发夹结构能够用来预测新的microRNA。将测序得到的序列比对到该物种的基因组后，截取附近区域的一段序列，通过折叠模型分析，如发现该序列位于茎环结构上，则初步判定该序列为一个候选的新microRNA(图6)。图6：新microRNA的预测6. MicroRNA表达模式分析根据研究需要，选择目标microRNA分子进行表达模式分析。同一组织中的microRNA表达谱见图7;不同组织中microRNA表达模式变化见图5-8，图5-8反映了microRNA表达的组织特异性。图7：部分microRNA在同一组织中的表达谱图8：两种microRNA在不同组织中的表达谱?hsa-let-7b和hsa-miR-22为两种microRNA,?A-J是10种组织7.两个样本的microRNA差异表达分析我们利用数学统计的方法对不同样品间的microRNA进行差异显著性分析，图5-9中游离的散点、图5-10中绿点和红点是有显著表达差异的microRNA。图9：两种样品间mic