免疫组化中经常出现的问题及对策.docVIP

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程要经过很多步骤和环节，而每一个步骤环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事，这需要病理技术人员和病理医师的密切配合、相互协调、共同努力才能完成。虽然免疫组化染色可以存在各种问题，但从染色结果看一般可分为两类：无色片(无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 l 无色片 即染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，有两种可能。 1．1 真阴性结果整个染色过程没有出现问题，组织或细胞中与抗体相关的抗原确实不表达。 1．2 假阴性结果即此阴性结果不是真实的反映。 1．2．1 切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，可能是病理医师对切片或抗体的选择错误。或是技术员选错蜡块，所以获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。故制作出合格的免疫组化切片不仅是技术员的事，病理医师也起着不可或缺的作用。 1．2．2 染色过程中的某一或某些环节出了问题。如：①组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；②抗体选用不当，选用了只能用于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；③一抗失效。虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也会遇到突然失效的情况，抗体长期不用和／或已超过有效期是主要原因；④ 染色过程中漏掉了某一环节。如忘记加二抗或三抗。或用了两次二抗而缺少三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。有一种简单的方法可避免这种错误，在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上。再将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上。观察是否出现棕色。如果出现则证明三抗和DAB的配制过程没有错误；如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以旆；如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB及其配制过程。这种方法能迅速地帮助我们找出问题的原因；⑤抗体未完全覆盖测试组织，当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所用试剂均没有问题。此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照也没有着色，表明染色过程中的某个或某些步骤出了问题。或试剂出了问题。应一 一寻找原因。阳性对照包括两种：一种称为自身对照或内部对照。这是指在测试的切片中存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原。CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照。对照和要测试的组织、细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时，最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为外部对照。有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑存在恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart—l来检测，而正常胃组织本身不存在相关抗原，如果病变出现阳性反应 结果，就能提示是恶黑，但如果出现阴性结果。就无法确定是组织自身不合黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为外部对照。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前，国内、外均有单位将多种不同组织集合在一起，制成多组织切片、“腊肠”、“春卷”切片、组织芯片等，将其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法是采用阑尾切片作为阳性对照，因为与人体其他组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，含有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管和间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医师的工作或责任，而不是技术员的责任。病理医师观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应该告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医师在免疫组化检测中的作用不可忽视。 2 “杂音”染色片 免疫组化除正常的、真实的阳性信号外常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，将其归纳为下面几种。 2．1 全片着色 全片着色是指整个切片全部染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清哪些组织是阳性哪些是阴性(图1)。出现这种现象有几种原因。 2．1．1 抗体浓度过高 一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找出适合自己实验室的理想工作浓度，即使是即用型的抗体也应如此，不能只简单地按说明书进行染色。 2．1．2 抗体孵育时间过长或温度较高 解决办法是严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时