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干扰素在肝癌治疗中耐药性问题探究作者单位：262500 山东省青州市高柳中心卫生院 通讯作者：徐蕊 【摘要】 目的 探讨干扰素受体表达水平与临床疾病二者之间进展的关系，从而更进一步研究干扰素应答的相关机制和因素。方法 采用流式细胞技术和细胞免疫组化对三组患者的外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞膜进行检测。结果 通过检测干扰素受体水平发现，肝癌组和对照组干扰素受体水平存在明显的差别，即肝癌组患者的受体水平低于对照组。结论 产生干扰素耐药的肝癌患者组的干扰素受体（IFANR2）水平明显降低。 【关键词】 干扰素耐药； 肝癌； 流式细胞术； 免疫组化 干扰素（IFN）的分泌是病毒感染后机体最先启动的防御机制，在细胞培养体系及动物模型中，IFN可以抑制多种DNA及RNA病毒的复制［1］。研究发现，尽管IFN是目前公认的治疗肝癌较为有效的药物，但干扰素耐药现象严重。学者们正在努力寻找影响干扰素应答率的预测指标，以提高疗效。本试验笔者利用流式细胞术和细胞免疫组化方法检测外周血相应细胞表面干扰素受体的表达，从而更进一步来探究干扰素的耐药现象，报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 外周血单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞采自15名肝癌患者，其中男8例，女7例，平均年龄（35.3±4.6）岁。其中8名肝癌患者（肝癌组）是经过长期干扰素治疗同时又未给予手术治疗的对干扰素反应性下降的患者，余7名肝癌患者（阳性对照组）为未经手术治疗但对干扰素有一定反应性的患者。5例门诊健康体检者为对照组。所有患者均进行血常规、血生化、B超、血清肝癌特异性抗原检测。 1.2 实验方法 1.2.1 免疫组化 外周血细胞的分离用常规的方法分离外周三种细胞，马上滴在载玻片上，待玻片上细胞干后，立即用丙酮进行固定，30 min后放入-70 ℃冰箱，统一进行免疫组化。实验步骤：（1）采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法操作。载玻片放入室温下10 min溶化，用过氧化物酶封闭试剂封闭内源性过氧化物酶5 min；（2）在枸橼酸那盐缓冲液中进行微波炉抗原热修复3 min；（3）磷酸盐缓冲液（PBS）连续洗2次，每次5 min；（4）将切片标本置于湿盒内加10%正常兔血清，室温下放置15 min；（5）弃去多余血清，加入抗生物素蛋白封闭试剂，室温下放置15 min；（6）PBS洗后小心的擦掉多余PBS加入生物素蛋白封闭试剂室温下孵育15 min；（7）PBS漂洗后滴加一抗1∶1000（兔抗人alpha/betachainZ 受体多克隆抗体，为美国服RD公司产品），放入4 ℃冰箱过夜；（8）PBS连续洗2次，每次5 min，滴加二抗（生物素标记羊抗兔，美国RD公司产品），37 ℃孵育55 min；（9）PBS连续洗2次，每次4 min，滴加酶标底物（辣根酶标记链霉菌亲和素，美国RD公司产品），37 ℃ CO2孵育30 min；（10）PBS连续洗2次，每次2 min，DAB显色，苏木素复染，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。阴性对照采用PBS代替一抗。 1.2.2 流式细胞技术 对慢性肝病患者的干扰素受体进行分析和指标检测。采集静脉血1 ml置于EDTA-K2抗凝管内，在5 h内进行干扰素受体（IFNRA2）表达检测。取肝素钠抗凝外周血100 μl 2份，分别加入荧光素标记的羊抗小鼠IgG1-FITC（control）和IFN-α/βRα（H-11）（实验管）20 μl；将10×溶血素稀释成1×,加入1×溶血素1 ml，使红细胞溶解；加入PBS 1.5 ml；实验管加入羊抗小鼠IgG1－FITC 20 μl，室温避光孵育20 min;实验管加入PBS 2.5 ml；加入1%多聚甲醛1 ml。标本置流式细胞仪（FACSCalibur型 美国Becton Dickinson公司产品）检测。选定单核细胞,淋巴细胞，中性粒细胞，每次每样标本细胞数均大于10 000个。 1.3 统计学处理 应用SASS 16.0统计软件整理并分析所得数据。计量资料以平均数±标准差来表示。采用方差分析和秩和检验。P 1