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实验三、固定化酵母细胞发酵生产酒精 实验目的 了解固定化细胞的方法； 了解包埋法的操作； 了解固定化细胞的意义。 实验材料 菌种：酵母菌； 发酵培养基：2％蔗糖溶液； 试剂：2.5%海藻酸钠溶液，1.5%CaCl2， （以上均需高压蒸汽灭菌） 其它材料：无菌生理盐水，滴管或无菌注射器。 实验原理 固定化的定义和优缺点； 比较各种固定化细胞的方法； 包埋法对载体的要求； 固定化的知识 定义：通过理化方法将游离的细胞或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性、可反复使用的技术。 固定化酶和固定化细胞统称为固定化生物催化剂。 优点：1、可反复使用，实现了发酵过程的连续化； 2、酶或细胞易于与发酵液分离，简化了后续处理的工艺、提高了发酵产品的质量和收率； 3、抗污染性强； 4、对于胞内酶，可直接固定化细胞，无需破碎细胞、分离纯化酶，提高了酶的活性和稳定性； 5、固定化细胞可利用胞内的复合酶系，催化一系列反应； 6、固定化增殖细胞可再生酶促反应的辅助因子，提高反应效率。 缺点：有时固定化后，酶或细胞接近底物的阻力增加，可能导致反应效果下降。 比较不同固定化的方法 方法 原理 优点 缺点 无载体法 通过选择性热变性或助凝剂使细胞自身絮凝 可获得高密度的细胞，条件较为温和 机械强度较差 吸附法 通过载体表面与酶、细胞之间的疏水作用或静电作用等将细胞固定 操作简便，条件温和，不影响细胞或酶的活性，载体可再生 载体与酶、细胞之间的结合力较弱，易脱落 共价结合法 载体表面的功能基团与酶、细胞上的非活性基团进行共价结合 结合力强 反应较剧烈，酶和细胞的活力会损失 包埋法 将酶、细胞定位于一定孔径的凝胶网格中或微胶囊内 机械强度高，包埋率可通过调节凝胶材料的浓度来改变，条件较为温和 扩散阻力较大，限制了酶或细胞的催化活力，故较适合于小分子底物和产物的反应 交联法 通过多功能试剂将细胞彼此交联起来 结合力强，可获得高密度的细胞 机械强度较差，反应较剧烈，酶和细胞的活力会损失 固定化方法选择的原则 固定化后的通透性（传质能力） 固定化后的机械强度 固定化过程的安全性 包埋法载体的选择 包埋法较适合于固定化生长态的细胞，细胞可在凝胶网格或微囊中生长繁殖，细胞大多聚集在载体内表面，提高了细胞密度、减少了传质阻力。 但由于活细胞生长代谢，载体会受到物理、生物破坏。 要求：1、有一定的机械强度； 2、对酶、微生物、酸碱有耐受力； 3、固定化过程尽量温和，避免酶、细胞损伤； 4、凝胶网格通透性好，其孔径可调节； 5、廉价易得，无毒。 常用的载体：天然高聚物——卡拉胶、海藻酸钙、醋酸纤维素酯等； 合成高聚物——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。 本实验所用载体的特点 材料 原理 优点 缺点 海藻酸钙凝胶 海藻酸钠是一种天然高分子多糖，能够于Ca2+螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶。 调节海藻酸钠溶液的浓度可改变固定化颗粒的机械强度和传质阻力， 调节CaCl2溶液浓度可改变固定化颗粒的机械强度。 操作方便，毒性小， 抗微生物分解能力弱，机械强度较低（在高浓度的单价金属离子和磷酸盐缓冲液的作用下，凝胶结构会破坏） 实验步骤（无菌操作） 海藻酸钙凝胶包埋酵母细胞 取酵母菌悬液和2.5%海藻酸钠溶液（35℃预热）各5mL于无菌小三角瓶中，混匀； 用无菌注射器将混合液以缓慢而稳定速度滴入1.5%CaCl2溶液（35℃预热）中； 放置15-20min（钙化过程，至形成坚固的凝胶颗粒），用无菌水洗涤凝胶颗粒2～3次，沥干后，倒入2％蔗糖溶液，28 ℃静置培养。 实验结果 30度培养箱静置7天 DNS法检测发酵液中是否有还原糖。 蒸馏浓缩酒精，测定酒精浓度 思考题 简述固定化技术的意义。 固定化一周后结果观察 还原糖的检测 酒精度的检测用旋转薄膜蒸发仪将酒精蒸馏，并用酒精密度计检测酒精度数。 试剂 发酵液（mL） 1 蒸馏水（mL） 0.5 DNS液（mL） 1.0 沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记录测定组OD540nm，并与之前酵母蔗糖酶提取实验中的数据比较。