固体发酵培养南海红树林内生真菌1403#次级代谢-中山大学化学学院.doc

固体发酵培养南海红树林内生真菌1403#次级代谢产物研究 蔡奕彪 蔡小玲 （中山大学化学与化学工程学院海洋天然产物有机研究所；广东省生物功能分子重点实验室，广东 广州 510275） 摘要：海洋红树林内生真菌次级代谢产物化学结构新颖、种类繁多，是天然药物先导化合物的重要来源。本文对南海红树林内生真菌1403#进行了固体发酵培养，得到醌类等类型的化合物。 关键词：红树林内生真菌；次级代谢产物；固体培养 海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性。海洋微生物因其特殊的生存环境而具有产生新型生物活性物质的巨大潜力。近年来，从海洋真菌中分离鉴定了许多结构新颖的次级代谢产物，这些化合物显示了良好的抗肿瘤、抗细菌或抗真菌等生物活性，为新药的开发和各种疑难疾病的治愈提供了新的希望[1]。 红树林是一种热带盐滩上特有的植物群落，因此组成这个群落的几种主要种类在形态、生理、生态的各个方面都有它的特殊性：主要表现在胎萌现象以及根系的多样性中，以及红树林区经常受到海水的浸淹，土壤中的含盐量很高（一般在4.6~27.8‰之间），因而红树植物绝大部分属于盐生植物，具有排除或分泌盐分的结构，能将吸入体内的盐分分别经过茎、叶表面分布的盐腺排出，排在茎、叶表面的盐分晶体被雨水等淋洗掉。如桐花树、海榄雌等植物，就有泌盐的机能，能排除过量的盐分，以适应高盐度的基质[2-3]。 在固体发酵中，菌体可以更高效地利用培养基中的营养物质，促进次级代谢产物的产生，同时，可能是因为固体发酵更好的模拟了其生活环境，且当菌株附着与固体基质上生长时，供氧丰富，生长密度大，生存竞争更为激烈，因此产生的次级代谢产物的量也会提高。固体发酵还有含水量少，废水、废渣少，环境污染少等优点[4]。 醌类化合物 (quinonoids) 指分子中具有不饱和环二酮结构（醌式结构）或容易转变为这种醌式结构的天然有机化合物。主要包括:苯醌、萘醌、菲醌、蒽醌四类。它是一种色素，在植物中主要存在于蓼科大黄、何首乌、虎杖；茜草科茜草、豆科决明子、番泻叶、百合科芦荟、唇形科丹参、紫草科的紫草等。近年来，随着人们对海洋微生物次级代谢产物研究的深入，一些海洋来源的、结构新颖的且具有良好生物活性的的醌类化合物相继被发现，它们所表现出来的抑菌、抗氧化、诱导细胞凋亡等方面的生物活性比陆生来源的往往要好很多[5]。 1 实验部分 1.1 实验试剂和仪器 (1) 培养、分离、确定化合物结构所用的葡萄糖为化学纯，蛋白胨 (BR), 酵母膏(BR)，粗海盐 (微生物养殖用)，琼脂(BR)，其它实验用试剂均为市售(AR) 试剂。薄层层析是用青岛海洋化工厂生产的硅胶GF254柱层析硅为青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶Sephadex LH-20葡聚糖凝胶。 () 核磁共振谱用Varian INOVA 500NB 400NB 与300NB 核磁仪测定H NMR谱500MHzC NMR 谱125MHzTMS 内标) HREIMS 用VG Autospec-500 质谱仪红外光谱用EQUINOX55-A590/3F(Bruker)红外仪测定紫外光谱用日本岛津公司的UV-2501PC 紫外和可见吸收光谱测定元素分析用德国Elementar 公司的Vario EL CHNS-O 元素分析仪熔点用北京X4 型显微熔点仪测定。Agilent 1100 型高效液相色谱仪Waters 515 HPLC 泵Waters 2487 双波长检测器浙江大学N-2000 双通道色谱工作站。内生真菌1403为盐生坚座壳种（Halorosellinia sp.）真菌，来自香港红树林树叶内部，由香港城市大学 L.L.P. Vrijmoed 教授等分离得到，菌种保存在香港城市大学、中山大学和武汉大学中国典型培养物保藏中心内。固体培养基g蛋白胨5 g酵母膏、10 gNaCl1.5%的琼脂，加dH2O溶解后，调pH至7.4，1 L，115 ℃，20 min灭菌℃培养箱中培养25天。 1.3 提取和分离 近4升的固体培养基培养30天后，将固体培养基切碎，并用甲醇（MO）浸泡一周后，用纱布过滤，分离固体培养基和菌液，此过程重复3次，培养基晒干，菌液浓缩，再用乙酸乙酯（EA）萃取，EA提取物适量200-300 目硅胶拌，上柱粗分。分别用 5%，10%，20%，30%，50%，80%，100% 的石油醚淋洗，收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶纯化。晒干，浸泡。提取物浓缩拌硅胶过柱，以梯度淋洗。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶纯化。灰黄霉素为。易溶于氯仿，层析显示，紫外有强荧光吸收。FABMS 中得到分子离子峰 m/z 353 [M+1]+，而且在 MS 谱图中发现 [M]+[M+2]+为31，这分子中含有1个氯原子。结合核磁共振氢