蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测.doc

ICS11.020 C05 中华人民共和国国家标准 GB/T XXXXX—XXXX 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica （征求意见稿） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 前言 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。 本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测 范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。 本标准仅适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 乙酰胆碱酯酶 acetylcholinesterase 存在于生物体的一种水解酶，其生理功能是水解神经递质乙酰胆碱为胆碱和乙酸，在昆虫中主要存在于中央神经系统的突触膜上。乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，该酶的变构可以改变昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性而导致昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗药性。 2.2 等位基因 allele 同一基因的不同形式互称为等位基因。等位基因位于一对同源染色体上同一基因座上。编码家蝇乙酰胆碱酯酶342位点氨基酸的密码子有3种不同的非同义突变，产生三种不同形式的乙酰胆碱酯酶，不同型的乙酰胆碱酯酶对杀虫剂敏感性存在差异，其中342G为敏感型，342V和342A为不敏感型（附录A）。 样本采集 家蝇成虫样本从现场采集，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可短期（6个月）保存在4℃，也可储存于 -20℃ 或 -80℃条件下长期保存。 引物 引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。配制为10M浓度，保存于-20℃。 PCR仪 琼脂糖凝胶电泳仪 凝胶成像仪 恒温水浴锅 主要试剂 DNA聚合酶（Taq酶Bsp1286I 限制性内切酶EaeI 操作步骤 在PCR管中加入10×PCR buffer (含100mM Tris-HCL, 500mM KCl, 15mM MgCl2) 2.5μL，dNTP（2.5mM）2.0μL，引物F 0.5μL，引物R 0.5μL，单头家蝇的基因组DNA 1μL（100-300ng, 提取方法可参见附录B）和Taq酶 (2-5个单位)， 用水补齐至25μL，混匀。将PCR管放入PCR 仪中，设置PCR反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，35个循72℃ 10min。运行程序。PCR运行结束后，取5μL PCR产物在1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V, 电泳20min后在紫外光下检测，有清楚单一的60bp的条带的PCR产物用于进行以下酶切反应。取合格样品bp）的PCR产物设置两个酶切反应，反应A 用Bsp1286I酶、反应B用EaeI酶进行酶切， 酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录C）。将酶切后的产物上样在1.5% 的琼脂糖凝胶上，电压设定在160V, 电泳20min后在紫外光下检测。 根据酶切产物的电泳图谱(参见附录D)，确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型。 A ( 加Bsp1286I酶切) 反应B (加Eae I酶切) 乙酰胆碱酯酶342氨基酸位点基因型 361bp 、248bp 609bp 敏感型纯合子 （G/G） 609bp 609bp 不敏感 I型纯合子（V/V） 609bp 361bp、248bp 不敏感II型纯合子（A/A） 609bp、361bp、248bp 609bp 不敏感 I型/敏感型杂合子（G/V） 609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感II型/敏感型杂合子 （G/A ） 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感I型/不敏感II型杂合子（V/A ） （资料性附录）家蝇乙酰胆碱酯酶氨基酸位点突变对杀虫剂敏感性的影响 家蝇乙酰胆碱酯酶氨基酸位点突变对杀虫剂敏感性的影响