着重探析活化凝血因子5(FACTORVa)活性荧光定量检测试剂盒产品说.docVIP

活化凝血因子5（FACTOR Va）活性荧光定量检测试剂盒活化凝血因子5（FACTOR Va）活性荧光定量检测试剂活化凝血因子X（FXa）活化凝血因子（FVa）H-D-Phe-Pip-Arg-AMC，释放出荧光产物氨甲基香豆凝血因子5（Factor V）是维生素K非依赖性蛋白，由肝组织、内皮组织、巨核细胞、血小板等合成。凝血因子5凝血酶原复合物，包括活化凝血因子10、钙离子和磷脂等，其功能在于转化凝血酶原为凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），即活化凝血因子II（Activated Factor II；Factor IIa）。弥散性血管内凝血Disseminated intravascular coagulation；DIC）、原发性纤维蛋白溶解症primary fibrinolysis）等引起凝血因子5减少或缺失。凝血因子5缺失将导致凝血酶原时间（prothrombin time；PT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time；APTT）延长，而出现出血体质活化凝血因子X（FXa）活化凝血因子（FVa）一起，在钙离子和磷脂的参与下，使凝血酶原（prothrombin）转化为凝血酶（thrombin）基于由此水解人工合成的多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-7-amido-4-methyl coumarin（HD苯丙氨酰- pipecolyl精氨氨甲基香豆），释放7-氨基-4-甲基香豆7-amido- 4-methylcoumarin；AMC；激发波长），来定量测定活化凝血因子V的活性。其反应系统为：thrombin Thrombin H-D-Phe-Pip- Arg-AMC → H-D-Phe-Pip- Arg-OH + AMC 产品内容 液（Reagent ） 2毫升 液（Reagent ） 毫升缓冲液（Reagent ） 2毫升液（Reagent ） 1毫升底物液（Reagent ） 2毫升产品说明书 1份 保存方式 保存在-20℃冰箱里反复冻融； 底物液（Reagent ）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品的容器微型台式离心机：用于样品培养箱：用于反应物孵育 比色皿：用于样品测定的容器 酶标仪：用于样品分 实验步骤 样品制备准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管） 抽取1毫升血液，置于抗凝管里 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）放进4℃微型台式离心机离心分钟，速度为00g 小心移取400微升上清到新的1.5毫升离心管 放进－70℃冰箱里保存即刻置于冰槽里备用 测定准备 准备好待测样品，置于冰槽里 设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长0nm，散发波长0nm，并置零 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的置入冰槽里融化。 缓冲液（Reagent ） 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 分别加入微升液（Reagent ）到2至5号管 移取0微升 标准液（Reagent ）到1号管，混匀 小心移取微升1号管稀释的 标准液（Reagent ）到2号管，混匀 小心移取微升2号管稀释的 标准液（Reagent ）到3号管，混匀 小心移取微升3号管稀释的 标准液（Reagent ）到4号管，混匀 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表 管号 液（Reagent ） 标准液（Reagent ） 标准浓度 1 0微升 摩尔2 25微升 微升1号管 摩尔 3 25微升 微升2号管 摩尔 4 25微升 微升3号管 25微摩尔 5 50微升 0 0 标准曲线测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到 加入0微升上述配制的标准液加入微升液（Reagent ） 加入微升 底物液（Reagent ） （注意：避免气泡） 在37℃温度下孵育分钟 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数 重复实验步骤1至四次 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准浓度（摩尔） 样品测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到 加入微升上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔（注意：样品须清澈）加入微