western blotting 原理及体会.doc

Western blotting 全攻略 蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品印记和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白按分子量大小在凝胶中分成条带。第二部把凝胶中已分成条带的蛋白转移到一种固相支持物上，常用硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移，它又分为半干法和湿法之分，先打多用湿法。第三部是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所需要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的第一抗体的抗体杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。 一、 基本原理 第一部分：SDS电泳 1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷，为了是蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，会进行一些处理，即加入上样缓冲液（loading buffer）。其中所含的SDS和β-巯基乙醇可破坏蛋白分子间的二级三级结构，断开半胱氨酸残疾之间的二硫键，再经高温处理后，使蛋白完全变性和结聚，形成棒状结构同时整个蛋白带上负电荷；其所含的溴酚蓝，用于监控整个电泳过程；其所含的甘油或蔗糖增大溶液密度，可加速聚沉样品入凹槽底部。通电后被负电荷包裹的蛋白在凝胶中向正极移动。样品先通过高度多孔性的浓缩胶，使蛋白在分离胶表面聚集形成一条很薄的区带。 2、电泳启动后蛋白所带的电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电多者迁移快，反之则慢（电荷效应）；而由于胶孔径小，且成为一个整体的筛状结构，他们对大分子阻力大，小分子阻力小（分子筛效应），最终达到彼此分开的目的。 3、SDS胶分离范围： 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（KD） 15 10~43 12 12~60 10 20~80 8 36~94 5 57~212 第二部分：样品的印迹（转膜） 膜的选择：PVDF膜、NC膜、尼龙膜。我们常用PVDF膜，具有更好的蛋白吸附能力、物理强度以及具有更好的化学兼容性。 PVDF膜及滤纸预处理：转膜前，先甲醇15s，双蒸水2min，再转膜液至少5min。滤纸转膜前浸湿，赶出滤纸中气泡即可。 注：膜的处理是为了使膜上的部分集团充分活化，更有利于蛋白吸附。 转膜缓冲液：现用现配，其pH为8.3，比大多数的蛋白等电点（pI）高，因此蛋白带负电荷向阳极移动，所以安装夹层时，应该在黑色夹子一面（阴性电极）依次放上泡沫、滤纸、凝胶、转移膜、滤纸、泡沫。转膜液中最好不要含有SDS，其会严重影响转印效果；如果蛋白分子量比较大，可以适当加入一点，浓度在0.01%范围内。电泳后的胶最好再用清水洗下，除去running buffer中的SDS。 转膜时间： 目的蛋白分子大小（kDa） 胶浓度 转膜时间（h） 80~140 8% 1.5~2.0 25~80 10% 1.5 15~40 12% 0.75 20 15% 0.5 第三部分：免疫检测 影响抗原抗体反应的因素 电解质 常用1%脱脂奶粉作为抗体稀释液 酸碱度 抗原抗体反应一般在pH为6~8进行 温度 温度升高可以加速分子运动，使结合加速，若高于56℃，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性破坏，在40℃时，结合速度慢，但是结合牢固，常用抗原抗体反应温度为37℃。此外，适当震荡也可以促进抗原抗体分子的接触，加速反应。 二、基本操作流程： 提取细胞或组织蛋白、测定含量、蛋白样品变性 制备SDS胶 电泳 转膜 封闭 一抗 TBST清洗 HRP标记二抗 TBST清洗 ECL发光 X-光片曝光、显影 结果分析 三、操作流程中的细节注意 （一）蛋白样品制备 A、提前制冰，提前打开低温离心机。 B、全部操作需在冰上进行，防降解。 C、提取细胞蛋白需注意：裂解液不要加多，以6孔板为例，每孔一般为60~100μl，如果细胞密度小，每孔60μl，如果细胞密度大，每孔80~100μl，以增加蛋白浓度，便于后期实验。 D、贴壁细胞需注意：刮细胞时，需均匀，多次。 E、除脑组织等易剪碎样品外，其余组织需在剪碎外，做匀浆处理后，方可超声。 （二）蛋白样初步定量 蛋白样品初步定量，常用BCA法，后用Thermo 酶标仪测定。 A、 BCA法注意事项： 1、检测蛋白浓度时，样品是需稀释再检测 2、先加BCA工作液，再加样本和标准蛋白 B、 酶标仪方法：File - 打开 – demol – START，即可开始检测，十几秒内完成测定，插入优盘，导出数据 C、 配平蛋白浓度时，每孔上样蛋白不可低于20μg，上样量按30