微生物分子生态学的一些研究方法3生物标记物法.pptVIP

第二章、微生物生态学研究的基本方法 一、微生物生态学研究的传统方法 直接测定（代表性） 培养方法（可培养问题0.01-1%） 代谢活力的测定（同位素标记、酶活力、ATP、叶绿素、呼吸作用和光合作用） 数学方法（人工模拟实验） 二、现代分子生物学方法 （分子标记，基于PCR技术DGGE /TGGE，RFLP/ARDRA，T-RFLPs，单链构象多态性SSCP，随机扩增多态性DNA（ RAPD）分析,DNA测序(宏基因组测序), 培养技术） 微生物分子生态学的一些研究方法 3、生物标记物法（Biomakers ） 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。 环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术 1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。 16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致； 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性； 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。 构建环境16S rDNA文库的方法 用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (E.coli bases 1507 to 1492) “TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。 * * 优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离，能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有一定的客观性。 醌指纹法(Quinones Profiling) 呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q) 和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。 每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。 醌指纹法具有简单快速的特点。 磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析 脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。 甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。 脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。 磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。 未培养微生物资源的开发： 任何微生物培养技术和培养基都不能完全再现全部微生物的自然生存环境，使用免培养技术和基因组技术，直接分离土壤系统中群落水平的未培养微生物DNA样品并建立相应的生态基因组库，通过高通量筛选技术进行大规模的新的重要功能基因的研究，鉴定参与污染物降解与转化、各种抗酸、抗盐、抗湿、抗旱及抗（耐）重金属毒害等抗逆特殊功能基因。 我国科学加已经建立了深海样品、云南腾冲热泉，青海藏牦牛瘤胃、造纸厂废水排污口和传统堆肥未培养微生物的生态基因文库，获得了一批具有特殊性质和应用前景的淀粉酶、蛋白酶和脂酶编码基因。 *