RNA提取常见问题文档.docx

RNA提取常见问题点击次数：276 发布时间：2011-5-30?1、RNA降解A、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。B、新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。C、冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。D、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。E、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。2、OD260/280比值偏低A、蛋白质残留使用酚氯仿抽提，去除残留的蛋白质(但经此步骤操作，约损失40%的RNA)。B、盐分残留加入2.5倍体积的无水乙醇和终浓度是0.1M的NaCl沉淀RNA，-20℃放置30分钟充分沉淀RNA，然后4℃下10,000×g离心15分钟收集沉淀，溶于DEPC处理过的水中。C、设备限制测定OD260及OD280数值时，使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。3、RNA提取得率低A、使用样品过多，超过吸附柱的最大结合量使用过多的样品，将会导致RNA的降解。B、Wash Buffer中未加入无水乙醇使用前，需在DNA Wash Buffer和DNAse I Stop Buffer 中加入无水乙醇。C、洗脱不正确加入洗脱Buffer后，放置2~3分钟在进行离心洗脱。D、处理样品太多减少处理样品的量。E、样品中RNA本身含量低增加样品用量和裂解液用量。F、电泳检测时，换用新的电泳缓冲液，并尽量减少电泳时间。4、基因组污染A、RT-PCR反应中，使用过量的RNA减少RT-PCR反应中RNA模板的量至50~100 ng。B、使用过多的组织使用过多的组织将会导致大量基因组DNA的污染，减少起始组织样品的量。大部分组织采用30 mg，或者更少量的组织量不会出现基因组污染。C、增加裂解缓冲液的用量D、对有些本身DNA含量过多的样品，可使用RNAse-Free的DNAse I处理后进行后续实验。4、乙醇残留洗脱前应保证乙醇去除干净，可将吸附柱开盖离心2分钟。5、柱子堵塞A、裂解不完全，或者匀浆不彻底减少起始样品的量，或者增加裂解缓冲液的量，并增加裂解时间。B、上清中含有沉淀吸取上清时，小心操作避免吸起沉淀。提取过程中RNA降解? 1、样品中的RNA发生降解? 尽量选择新鲜的样品，样品采集后应迅速用液氮处理。? 材料保存在液氮中或-80℃条件下，材料均不宜长期保存，且避免反复冻融。? 幼嫩新鲜的材料RNA含量高且完整，衰老或病害等受损的材料中RNA降解比较严重。2、操作环境的RNase污染? RNA提取尽量选择洁净的环境，由于自然条件下空气中含有较多的RNase，建议对提取环境进行RNase的清除处理。? 3、提取用具带来的RNase污染? 提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活（160℃烘烤4-5?h）去除RNase。? RNA样品所接触的所有塑料制品（如枪头、电泳槽、移液器等都需要通过DEPC或NaOH处理严格去除RNase后才可使用? 4、RNA溶解用水带来的RNase污染? 配制DEPC处理水时需剧烈振荡使DEPC与水充分接触反应（DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分）。? DEPC处理后应避光静置过夜，高压灭菌。? 5、操作中带入的RNase污染? 人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的RNase。操作人员可通过经常更换一次性手套，佩戴口罩等措施减少此类污染。? RNA提取量低? 材料RNA含量较低? 对于RNA含量较低的纤维组织（肌肉组织或纤维素较高的植物组织）可适当提高起始材料的用量。? 材料中蛋白和脂肪含量较高? 蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。?? RNA沉淀条件不合适? 使用异丙醇沉淀RNA中，加入的异丙醇与提取液的比例为严格的1?：1?，否则会明显影响RNA沉淀的效率和RNA的纯度。特殊材料（如含有多糖、多酚等）可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。?