基因工程PCR及文库克隆法.pptVIP

（一）cDNA文库构建基本流程 RNA 的提取 合成 cDNA 第1链 cDNA 第2链的合成 将双链 DNA 克隆到载体中 分析 cDNA 插入片断 扩增 cDNA 文库 （一）、cDNA文库的建立 cDNA文库：指用一种生物的mRNA经逆转录合成的互补DNA所建立的文库。 1、mRNA分离 总RNA mRNA tRNA rRNA 2、合成cDNA第一条链 （1）随机引物引导法 （2）oligo（dT）引导法 （1）随机引物引导法 （2）oligo（dT）引导法 3′ 5 ′ mRNA AAAAAA T T T T T T 3′ 5 ′ AAAAAA T T T T T T Klenow酶 mRNA cDNA第一条链 3′ 5 ′ 5 ′ mRNA mRNA 3′ 5 ′ Klenow酶、连接酶、 3′ cDNA第一条链 dNTP dNTP 3、第二条链的合成 （1）自身引导法 （2）双链cDNA的置换合成 （3）引物-衔接头法双链DNA的合成 Clontech 1.基因文库的构建规模 （取决于基因组大小和插入片段的大小） 基因组文库的大小的估算： N=ln（1–P）/ln（1 – f） N：为基因组文库必需的克隆数目。 P：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率，一般为99%。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。 二、基因组文库的构建 例如人的基因组大小为3×106Kb，如果从人类的基因组文库中筛选长度为1.5Kb的珠蛋白基因，构建基因文库所需要的实际克隆数为： N=ln（1–0.99）/ln（1 – 1.5/3×106）=9.2×106 基因组文库应具有的克隆子数 基因组大小/bp 2×106（细菌） 2×107 （真菌） 2×109（动物） 理论克隆数 实际克隆数 理论克隆数 实际克隆数 理论克隆数 实际克隆数 克隆片段平均大小（bp） 5×103 400 1831 4000 18 418 600 000 2 763 110 10×103 200 919 2000 9208 300 000 1 381 550 20×103 100 458 1000 4603 150 000 690 774 40×103 50 278 500 2300 75 000 345 386 2.基因组文库构建一般流程 3.基因文库的筛选 3.1 原位杂交法 3.2 图位克隆法 3.2.1.染色体步移 3.2.2.染色体登陆 3.1 原位杂交法 三、转座子突变文库 用转座子作探针克隆出突变基因，再用突变基因做探针，从野生型个体中分离并克隆出野生型基因 1.转座子突变机制 转座子质粒 受体菌染色体 复制性转座子 非复制性转座子 保守性转座子 2. 转座子标签法的主要步骤： 提取转座子质粒 转座子转化导入受体细胞 通过受体表型的改变筛选突变体 通过转座子已知序列获得目的基因 从野生型受体中分离克隆目的基因 转座子标签法对阴沟肠杆菌B8 拮抗水稻白叶枯病菌相关基因片段的克隆与检测 黄海宁, 余旭平，陈卫良,龚鸿飞,李德葆 浙江大学学报(农业与生命科学版) 32(3):265～269,2006 二 基因克隆方法 -------PCR 利用DNA聚合酶在体外（in vitro）合成特异性DNA片段的技术,又称体外基因扩增技术。? Kary Mullis 1993年的诺贝尔化学奖 1、PCR技术扩增的步骤—三步曲 高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension） 2 PCR反应的DNA聚合酶选择 1 普通Taq酶（rTaq） 无3’-5‘外切酶活性