第18章基因工程.docVIP

第十八章 基因工程概论 重点：限制性内切酶的类型和用途； 各种载体的特点和用途；文库的构建方法；转基因的概念及常见的转基因技术。 难点：各种载体的特点和用途；文库的构建方法。 基因工程：是指从分子水平上对基因进 行体外操作，将外源基因加工后插 入到质粒和病毒等载体中，转化受 体细胞并使目的基因得以扩增和表 达，从而实现人们定向改造生物， 得到人们所需的生物性状或基因工 程产品的技术。 第一节 基因工程的基本原理 一、基因工程的主要程序 二、限制性核酸内切酶 三、载体 一、基因工程的主要程序1、目的基因的制备 2、重组DNA分子的构建 3、重组DNA分子转移受体细胞 4、转化子的筛选 5、目的基因表达与功能的鉴定 二、限制性核酸内切酶 1、限制性核酸内切酶：识别并切割特异 的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性内切酶的命名： 　　根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； 　　EcoR I来自大肠杆菌（Escherichia coli）； 　　Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 　　2、限制性内切酶的类别： 根据特性可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，目前应用最广泛的是Ⅱ型限制性内切酶。 Ⅱ型限制性内切酶的特点： 1）识别4-8bp的特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，从两个方向阅读其序列相同的序列）。且识别位点和切割位点一致。 2）切割产生平末端或粘性末端。 3）所产生的互补粘性末端可以配对并被DNA连接酶高效连接。 同裂酶：是指识别相同的位点的不同限制性内切酶。切割位点可以相同也可以不同。如SmaⅠ和XmaⅠ，它们均识别CCCGGG，但前者切割产生钝末端，后者切割产生粘性末端。 同尾酶：是指能切割产生相同末端的不同限制性内切酶。一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。 下图为部分常用的限制性内切酶： 二、载体 　 将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。 载体应具备的条件： 　 具有复制原点，能自我复制； 　 具有单个或多个克隆位点(multiple cloning site，MCS)，即有多种限制酶的切点； 　　选择时的遗传标记(如抗生素抗性基因），以此来筛选重组载体。 载体的种类： 质粒载体 λ噬菌体载体 粘粒载体 噬粒载体 克隆载体 人工染色体载体 穿梭载体 表达载体 1、质粒载体 （1）质粒的基本特性 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体的能自我复制的环状双链DNA分子。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。 　　质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 至几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。。 质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因等选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有： pBR322、 pUC18/19等。质粒载体能克隆小于6kb的外源DNA片段。 （2）质粒载体的类型 1）pBR322 pBR322 质粒的大小为 4361bp，含有30多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。目前使用广泛的质粒载体几乎都是由此发展而来的。外源基因可插入到这两个抗生素抗性基因当中，从而造成插入失活。　 2）pUC18和pUC19 pUC18和pUC19大小只有 2686bp，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段。由pBR322改造而来，它保持了pBR322的复制起点、氨苄青霉素抗性基因（序列有突变），增加了大肠杆菌乳糖操纵子的启动子和lacZ基因部分片段。其中lacZ基因内部增加了多克隆位点（MSC）。这两种载体的MSC排列方向正好相反。 2、λ噬菌体载体： λ噬菌体基因组全长为48502bp。λ噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，两端为DNA左、右臂。左臂的基因产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的形成。右臂的基因产物包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基