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1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，MCS）。 5、具有较高的遗传稳定性。 1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的DNA分子。 是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。 4、病毒 (5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。 平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用 下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端 连接要高些。 （4）同聚物加尾连接： （5）人工接头连接： 4、重组DNA导入受菌体 5、重组体的筛选与鉴定 筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子的过程。 1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组/敲除的技术基础 1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础 1987年，Thompsson et al首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善 同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除 适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞; 原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上 CRISPR-Cas系统基因修饰技术 Biotechnology: Rewriting a genome Nature?495,?50–51?(07 March 2013)?doi:10.1038/495050a 1 CRISPR-Cas概述 1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。 2013以后，研究者们在包括《science》和《nature biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。 1 CRISPR-Cas概述 CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 CRISPR-Cas主要由两部分组成： 识别 切割 1 CRISPR-Cas概述 1.1 CRISPR结构 CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。 1.1 CRISPR结构 1.2 Cas家族 Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 2 CRISPR-Cas系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。 2 CRISPR-Cas系统的发现 2 CRISPR-Cas系统的发现 2 CRISPR-Cas系统的发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。 2 CRISPR-Cas系统靶向要求 最主要的