叶绿体色素的提取分离理化性质和含量测定.docVIP

叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定 1 实验目的 （1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法； （2）验证叶绿体素的理化性质。 2 实验原理 2.1 叶绿素的提取 叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。 2.2 叶绿素的分离 薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。 2.3 叶绿素理化性质测定 叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。 2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1 cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 叶绿素a、b的丙酮溶液在的最大吸收峰分别位于663、645 nm处。nm下叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在645 nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） （1） （2）663nm和645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b浓度（1） （2） Ca=12.72 A663—2.59 A645 (3) Cb=22.88 A645—4.67 A663 (4) 将Ca+Cb相加即得叶绿素总量CT CT ＝ Ca十Cb＝20.A645—8.05 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下