酵母细胞的破碎及破碎率的测定.docVIP

PAGE 2 - 试验一 酵母细胞的破碎及破碎率的测定 一、实验目的 1.掌握超声波破碎细胞的原理和操作； 2.学习细胞破碎率的评价方法。 二、实验原理 频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下（100～250W）可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超生波细胞粉碎机，其工作原理是：JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。超声波发生器（电源）是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。 三、实验器材 超声波细胞破碎机，电子显微镜，酒精灯，载玻片，血细胞计数板，接种针。 四、试剂和材料 （1）酵母细胞悬浮液 0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH为4.7）。 （2）马铃薯培养基 ①马铃薯（去皮切块）200g；②琼脂20g；③蔗糖20g；④蒸馏水1000mL；⑤pH为6.5。 选优质马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，融化后补充加水至1000mL，分装，115℃灭菌20min。 五、操作步骤 （1）啤酒酵母的培养 ①菌种纯化。 将酵母菌种转接至斜面培养基上，28～30℃，培养3～4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中，28～30℃，培养24h。 ②扩大培养。 将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中，28～30℃，培养15～20h。 （2）破碎前计数 取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。 （3）细胞超声波破碎 ①将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中，液体浸没超声发射针1cm。 ②打开开关，将频率设置中档，超声破碎1min，间歇1min，破碎20次。 ③取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。计算细胞破碎率。 ④破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。用Lowry法检测上清液蛋白质含量。 六、结果与讨论 1、用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。 2、用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当的稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数，从而计算出破碎率；另一种是间接计数法，将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量，也可以评估细胞的破碎程度。 试验二 细胞核与线粒体的分级分离 一、实验目的 1.了解离心分离的原理； 2.掌握差速离心法分离细胞器的方法及操作。 二、实验原理 细胞内不同的结构，密度和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 （1）匀浆(Homogenization) 低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 （2）分级分离(Fractionation) 由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 （3）分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 三、实验器材 普通离心机，高速离心机，匀浆器，平皿，载玻片，显微镜。 四、试剂和材料 小白鼠，0.9%NaCl溶液，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙，1%甲苯胺蓝，0.02%詹纳斯绿B染液。 五、操作步骤 （一）细胞核的分离提取操作步骤 1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左