口腔-实验1-分光光度和蛋白测定-田海滨.pptVIP

掌握分光光度法原理 掌握双缩脲法、BCA法和考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的原理和操作 熟悉标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用 1760年，Lambert从实验中找到了吸光度A与液层厚度L的关系式： A = k1L k1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数 双缩脲（Biuret）法测定蛋白质含量 BCA法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝法（Bradford)测定蛋白质含量 【原理】 BCA(bicinchoninic acid) 即二喹啉甲酸，是目前比较理想的蛋白质定量方法。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将Cu2+还原为Cu1+ , Cu1+与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。 2.配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配置适量BCA工作液，并充分混匀。 注：配置BCA工作液前请将试剂A摇晃混匀。 3. 标准品及样品的测定 （1）分别取25ul上表中新鲜配置的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中。 （2）每孔中加入200ul BCA工作液，并充分混匀。 （3）加盖，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h。 （4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度。 （5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 BCA试剂A: 1%BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠，0.95%碳酸氢钠，混合调PH值至11.25。 BCA试剂B: 4%硫酸铜 牛血清白蛋白溶液：取0.2g牛血清白蛋白溶于100ml 0.9% NaCl溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 PBS缓冲液(pH7.2-7.4): NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 1.76mmol/L 。 微量加样器 Eppendorf管、试管 恒温水浴锅 微孔板 分光光度计 考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue G-250) G-250在酸性条件下和蛋白质(主要结合碱性或芳香族氨基酸）结合，使得燃料最大吸收峰从465nm变为595nm, 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 优点：操作简单、速度快，灵敏度高，与一些还原剂（如DTT、巯基乙醇）兼容 缺点：有些去垢剂、黄酮、碱性缓冲液会干扰测定。 3. 标准品及样品的测定 （1）将25μL样品加入到试管中，并用PBS补足到150ul。 （2）向各试管中加入2.85mL 考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5到10min。 （3）以0号管调零点，于595nm处测定各管吸光度。 （4）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 牛血清白蛋白溶液：取0.2g牛血清白蛋白溶于100ml 0.9% NaCl溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 PBS缓冲液(pH7.2-7.4): NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 1.76mmol/L 。 1. 微量加样器 2. Eppendorf管、试管 3. 恒温水浴锅 4. 分光光度计 BCA法测定蛋白质含量 优点：灵敏，操作简单，受去污剂影响小，形成络合物稳定。 缺点：相对昂贵 1.5mL离心管 ddH2O (μL) 2mg/mL BSA (μL) 蛋白质终浓度 (μg/mL) A 0 300μL 标准品 2000 B 125 375μL 标准品 1500 C 325 325μL 标准品 1000 D 175 175μL B管混合液 750 E 325 325μL C管混合液 500 F 325 325 μL E管混合液 250 G 325 325μL F管混合液 125 H 400 100 μL G管混合液 25 I 400 0 0 =Blank 1.标准品的稀释： 将9支干燥离心管编号,按表加入下列试剂： 【操作步骤】 【试剂】 【器材】 考马斯亮蓝法（Bradford)测定蛋白质含量 【原理】 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和颠倒混匀。 标准品的稀释： 将8支干燥的试管编号，按表加入下列试剂： Reagent Blank/0