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c—KIT在不同毛色山羊皮肤中表达 摘要：为了研究c-KIT在不同毛色山羊皮肤组织中的表达与定位并探索c-KIT在毛色形成中的作用机制，以黑山羊、白山羊为研究对象，利用实时定量PCR技术分析其相对表达量，并采用免疫组织化学技术进行c-KIT表达定位分析。结果表明，在山羊皮肤组织中，c-KIT主要分布在皮肤上皮部、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部以及内外根鞘。c-KIT在黑山羊、白山羊毛色皮肤组织中表达部位、表达水平无显著差异，表明c-KIT的表达量、表达部位不是造成黑山羊、白山羊色差异的主要因素。　　关键词：c-KIT；山羊；免疫组织化学；皮肤；毛色　　中图分类号：S827.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0038-03　　绒、毛及裘皮是山羊重要的经济性状，毛色表型特征的选育尤其受到各国育种人员的关注[1]。探索山羊毛色形成的机制可以为培育天然的彩色山羊提供理论基础。哺乳动物的毛色表型特征主要是由毛发中黑色素的类型、数量决定的。c-KIT 编码的蛋白表达于黑素细胞前体物，肥大/干细胞生长因子的受体（mast/stem cell growth factor receptor，c-KIT）属于跨膜酪氨酸激酶受体，参与黑素细胞形成、成熟、增殖、分化及迁移等过程[2-4]。经过伊马替尼处理的人表皮黑素细胞中，由于c-KIT不能被磷酸化，从而可以抑制黑素细胞的迁移[5]。张巧灵等通过免疫组化分析得到Kit蛋白，在白色羊驼皮肤毛囊内根鞘、外根鞘及其结缔组织中有一定量的表达，但其在黄色羊驼表皮下层的结缔组织中只有很少量的表达[6]。Kit在白色羊驼中显著表达，其相对表达量是棕色羊驼的4.602 9倍[7]。但是关于c-KIT在山羊皮肤组织内的表达及其是否与山羊毛色的形成有关未见报道。本试验以黑色山羊、白色山羊为研究对象，首次对c-KIT在不同毛色山羊皮肤组织中的表达定位进行了研究，在转录水平对其在不同毛色山羊皮肤组织中的表达情况进行了检测，探索该基因与山羊毛色形成的关系，旨在为研究c-KIT调控山羊毛色形成的分子机制提供依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　在河北省定州市随机挑选成年白色山羊、黑色山羊各3只，选取体侧部位皮肤，用刮毛器刮净羊毛，用手术法取 1 cm2 左右皮肤组织6块。将用于总RNA提取的3块皮肤快速投入液氮中保存，将用于免疫组织化学分析研究的3块皮肤投入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋后制成组织切片。　　1.2主要试剂和仪器　　兔抗人c-KIT抗体（购自Santa Cruz Biotechnology INC公司）；封闭用山羊血清工作液、生物素标记的羊抗兔IgG、Streptavidin-HRP工作液、DAB显色试剂盒（均购自康为世纪公司）；苏木素（Solarbio公司）；RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；荧光定量试剂盒（日本东洋纺公司）；其他常规试剂均使用国产分析纯试剂。PCR仪（德国Biometra公司）；iQ5实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；核酸蛋白测定仪ND2000 （Thermo公司）；高速冷冻离心机（Sigma公司）。　　1.3总RNA的提取以及反转录合成　　取冻存的山羊皮肤组织，按照RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，利用核酸蛋白测定仪进行浓度与纯度测定，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。使用M-MLV反转录酶进行cDNA第一链合成，配制模板RNA 10 mu;L、oligo（dT）18 5 mu;L、RNase free ddH2O 15 mu;L的混合液；70 ℃保温 10 min，冰上急冷2 min。短暂离心后分别加入10 mu;L 5times;M-MLV Buffer、2.5 mu;L 10 mmol/L dNTP Mixture、1.25 mu;L Recombinant Ribonuclease Inhibitor、1.25 mu;L Reverse Transcriptase M-MLV和5 mu;L RNase free ddH2O。42 ℃保温1 h，70 ℃保温15 min后冰上冷却。逆转录产物保存于-20 ℃备用。　　1.4山羊皮肤组织中c-KIT的qRT-PCR　　1.4.1反转录合成c-KIT的cDNA根据山羊c-KIT的基因序列以及GADPH的基因序列，利用Primer 5.0软件设计特异性引物，由华大六合基因公司合成。引物序列如下：c-KIT基因正引物：5prime;-GGCCCACCCTGGTCATTACAGAATAT-3prime;，反引物：5prime;-TGTCTGCCGCCTTGGTTGGTAC-3prime;，预期扩增片段大小为225 bp；GADPH基因正引物：5prime;-CACCCTCAAGATTGTC