黑木耳多糖对ICR小鼠皮肤光老化保护作用.docVIP

黑木耳多糖对ICR小鼠皮肤光老化保护作用[摘要]目的：探讨黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharide,AAP）对ICR小鼠皮肤光老化的保护作用。方法：选取健康雌性ICR小鼠共50只，随机分成5组各10只：正常组(A)、模型对照组(B)、模型+AAP低剂量（50 mg/kg.d）灌胃组(C)、模型+AAP中剂量（100 mg/kg.d）灌胃组(D)、模型+AAP高剂量（200 mg/kg.d）灌胃组(E)。长波紫外线（ultraviolet A, UVA）联合中波紫外线（ultraviolet B,UVB）照射小鼠制备皮肤光老化模型。每周一、三、五照射，第1周每次照射时间1h，以后每周依次增加1h，自第5周起为5h，直至第14周照光结束。每次照光前各治疗组小鼠给予不同浓度的AAP灌胃。实验结束后取小鼠背部皮肤用测试盒测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX）活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；组织切片HE染色观察皮肤结构改变。结果：与正常组比较,模型对照组皮肤组织中SOD、GSH-PX活力显著降低（P 皮肤光老化是皮肤外源性老化的一个重要组成，是由自然光或人工紫外线（ultraviolet ,UV）光源反复照射引起的皮肤损伤[1]。日光中的长波紫外线（UVA）及中波紫外线（UVB）与光老化的发生密切相关。其发生机制之一是紫外线引起皮肤组织产生大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢和单线态氧[2]， 使机体发生氧化应激，造成细胞和组织的损伤。SOD、GSH-PX是机体重要的抗氧化酶，MDA是机体细胞膜受自由基攻击后产生的脂质过氧化产物，三者的测定相互配合能间接反映机体细胞受氧化损伤的程度。研究发现黑木耳多糖具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗凝血、抗突变、防辐射等生物活性[3]，有清除超氧阴离子、抗氧化及保护线粒体的功能[4]。本研究采用UVA联合UVB照射ICR小鼠建立光老化模型，探讨黑木耳多糖灌胃治疗对小鼠皮肤光老化是否具有保护作用。 1 材料和方法 1.1 材料：雌性断乳ICR小鼠,体重18～22g,由西安交通大学实验动物中心提供；40W紫外线灯管UVB4支、UVA2支，购于合肥赛帆试验设备有限公司； SOD、GSH-PX、MDA测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；黑木耳多糖（纯度60%）购于西安斯诺特生物技术有限公司，常温干燥保存；可见光分光光度计、离心机、恒温水浴箱等。 1.2 造模:40W紫外灯管（UVB4支，UVA2支）并列装于木箱制成灯箱[5],将除正常组以外的各组小鼠分笼放入灯箱中照射，小鼠背部距灯源30cm。每次照射前灯管预热15分钟。首次照光前一天用电推剪和市售脱毛膏给小鼠背部脱毛,脱毛面积约9cm2，以后每周脱毛1～2次。每周照射3次（周一、三、五），第1周每次照射1h，以后每周每次增加1h，自第5周起每次5h，直至第14周照光结束。 1.3 动物分组及处理:ICR小鼠50只随机平均分成5组：正常组(A)、模型对照组(B)、模型+AAP低剂量（50mg/kgd）灌胃组(C)、模型+AAP中剂量（100mg/kg.d）灌胃组(D)、模型+AAP高剂量（200mg/kg.d）灌胃组(E)。将黑木耳多糖溶解在生理盐水中配制成灌胃液。正常组及模型对照组灌胃相应体积的生理盐水。各组均在每次照光前称体重、灌胃。 1.4 取材：最后一次照光结束24h后用6%硫化钠溶液给小鼠背部脱毛。脱毛24h后腹腔注射水合氯醛处死小鼠，立即取下背部脱毛处全层皮肤。一部分放入10%福尔马林溶液中固定过夜，制作病理组织切片，HE染色。一部分皮肤去除皮下脂肪，在冰冻的生理盐水中漂洗，冷冻于-70℃冰箱以制备组织匀浆。 1.5 10%皮肤组织匀浆的制备：将皮肤用滤纸拭干，称重放入小烧杯中，加人冷生理盐水(生理盐水的总量是皮肤组织块重量的9倍)，尽快剪碎后移入玻璃匀浆器制成匀浆[6]用于测定GSH-PX、SOD活力及MDA含量。 1.6 指标测定：SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法；GSH-PX是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，其活力以催化GSH的反应速度来表示； MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。各项指标的具体测定步骤按测试盒说明书。组织蛋白含量用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定。每项指标的吸光度用可见分光光度计测定