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不同基因型青花菜游离小孢子培养几个方法分析 　　　青花菜（ Brassica oleracea var. italica） ，俗名绿菜花。由于其营养价值高，尤其是在抗癌功能上为同类蔬菜之首，深受消费者青睐。我国青花菜品种多为国外引进，种子昂贵。为培育新的种质资源，育成优质青花菜品种，常规方法需经过杂交、回交和自交分离，选育出理想的材料常常需要好几个世代。而在青花菜育种中利用小孢子组织培养，不仅可快速得到双单倍体纯系，还可大大缩短育种年限[1-4]。自1982年至今，甘蓝型油菜小孢子培养获得胚状体后，国内外利用游离小孢子培养技术在芸薹属作物上相继取得成功[5]，1991年Takahata等[6]首次利用青花菜进行了小孢子培养，随后张德双等[7]、王春丽[1]等也在青花菜游离小孢子培养上取得了成功。虽然小孢子培养技术日趋成熟，但很多学者侧重于对小孢子胚胎发育的诱导因素进行研究，本试验以5个不同基因型的青花菜为材料，对游离小孢子培养与植株再生进行了研究，旨在完善青花菜小孢子培养技术，同时也可为青花菜的遗传育种提供新的材料。 　1 材料和方法 　1.1 材 料 　供试材料由天津科润蔬菜研究所提供，供试材料于2012年10月定植于天津市科润蔬菜所，采取常规栽培管理，翌年3”4月植株出现花蕾后，选取主花序上的花蕾进行小孢子培养。 　1.2 小孢子培养方法 　参考张德双等[7]的研究，取处于单核晚期和双核早期的花蕾（4.1～5.0 mm）的小孢子进行培养。小孢子的分离、纯化培养参考赵前程等[8]的方法，用50 g·L-1质量浓度的次氯酸钠溶液进行表面消毒，经无菌水冲洗，用含蔗糖为100 g·L-1的B5培养基进行游离、洗涤，用含蔗糖为130 g·L-1，pH 值5.8，添加6-BA（1 mg·L-1）和NAA（0.1 mg·L-1）的NLN液体培养基进行小孢子培养，并添加一定的活性炭，培养密度为1times;105～2times;105个·mL-1，热激后，置25 ℃培养箱中继续暗培养，利用倒置显微镜观察小孢子发育进展。 　1.3 胚胎发生与胚培养 　小孢子受到热激后开始细胞分裂，黑暗培养2周左右，肉眼可见胚状体。30 d左右，胚状体处于子叶期，转移至添加6-BA（0.2 mg·L-1）和NAA（0.02 mg·L-1）的MS培养基上，形成再生芽。 　1.4 植株再生与移植 　将小孢子的再生芽在MS培养基上进行生根培养，形成完整植株，对试管苗进行增殖培养，扩大植株数量，加快育种，经过驯化移栽到含基质的盆钵中，待小植株成活后，移栽至大田，进行管理。 　2 结果与分析 　2.1 小孢子离体培养的生长发育观察 　经过热激的青花菜小孢子逐渐膨大（图1-A），2周左右，小孢子从多细胞团结构，逐渐发育成球形胚（图1-B）、心形胚（图1-C）、鱼雷胚（图1-D）和子叶胚（图1-E），将子叶胚置于光照下培养5～7 d，可见胚状体萌发，10～15 d左右，形成丛壮苗（图1-F），利用丛壮苗在MS培养基上进行生根培养，7 d左右，可见植株的基部产生大量白色的粗壮的根，形成健壮植株（图1-G）。 　2.2 不同基因型小孢子胚诱导的差异比较 　由表1可以看出，供试的5个材料中，只有两个形成了小孢子胚，胚胎诱导成功率为40%。不同基因型的小孢子胚诱导成功频率存在差异，11J-52每花蕾平均产胚数达到2.1个，而11J-63仅有0.5个。在未出胚的3个基因型中，11J-150和11J-158都观察到了细胞膨大，11J-173观察到了细胞分裂，说明它们对培养条件产生了反应，但却未能继续发育。由此可见，基因型对小孢子胚胎发育有明显影响。 　2.3 小孢子植株再生 　再生植株在花球形成期和开花期存在分离情况见图2。11J-52和11J-63两种材料均未采用任何加倍处理，两份材料产生的再生植株只有少部分植株不能表现出十字形花冠，而呈现出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交结角。 　3 结论与讨论 　利用小孢子培养不仅能够快速有效地获得纯系植株，加快青花菜的育种进程，而且利用单倍体植株的突变来筛选抗病、抗旱、抗虫的青花菜植株显得更加便捷[9]。 　基因型是制约小孢子发育的重要因素[10]。在相同的试验条件下，不同基因型诱导小孢子发育的频率差异很大，本研究中，基因型11J-52达2.1个，而11J-63则仅有0.5个，其他3个基因型（11J-150，11J-158，11J-173）则只有细胞膨大和部分细胞分裂，这个结果可以为青花菜游离小孢子培养提供理论依据。但是，关于小孢子培养的启动机制、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的研究仍在探究过程中。 　本试验中同时还发现高温热激可以启动小孢子分化，但是，热激又会