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酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
实验名称 实验方式 小组成员 实验五：纤维素酶米氏常数——Km的测定 小组合作 XX
XX
XX
XX 实验目的
1.1 了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2 掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验仪器、试剂和溶液：
2.1 仪器：
紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、标签（若干）等。
2 .2 试剂和溶液
2 .2.1 柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.8
2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）
2 .2.3 DNS试剂（CMCA-DNS）
2 .2.4 稀释到200倍的纤维素酶液
3、实验原理或装置示意图：
3.1 原理: Km定义：
Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。
3.2 Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。
Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。测定Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值
在0.01-0.00001mmol/L。（0.01～100mol/L）
3.3 米氏方程：
V[S]
v = Km + [S ]
v ： 反应初速度 （微摩尔浓度变化/min)
V ： 最大反应速度 （微摩尔浓度变化/min)
[S]： 底物浓度 （mol/L)
Km： 米氏常数 （mol/L)
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度 之间的定量关系。
3.4 双倒数作图法测定Km值：
1 Km 1 1
v V [S] V
1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。
本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。再根据林贝法作图求出Km值。
3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：
4 .1 实验方法与步骤：
1、将预先准备好的200倍纤维素酶液酶准确稀释到10000倍待用。
2、每个底物浓度取三支250 ml试管，一直空白，两只对照，待用。
3、预热： 参照下表：
表一 纤维素酶Km值的测定各管中底物液、缓冲液和酶液的用量ml
CMC-Na溶液（10 mg/ml ） pH4.8柠檬酸钠缓冲液 酶液 最终CMC-Na浓度（g/ml）
0.2 1.8 0.5 1
0.4 1.6 0.5 2
0.6 1.4 0.5 3
0.8 1.2 0.5 4
1.0 1.0 0.5 5
1.2 0.8 0.5 6
1.4 0.6 0.5 7
1.6 0.4 0.5 8
1.8 0.2 0.5 9
2.0 0.0 0.5 10
注：DNS与定容用的蒸馏水分别为：3 ml，19.
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