重组工程法构建德胺糖生物合成基因蔟的表达载体.docVIP

重组工程法构建德胺糖生物合成基因蔟的表达载体 　 朱蕾　谢峰　尚广东* (南京师范大学生命科学学院 江苏省生物多样性与生物技术重点实验室　南京 210097) 摘要：德胺糖是次级代谢产物来源的微生物药物中的一个重要的糖集团。为构建德胺糖生物合成基因蔟的异源表达体系，本研究运用重组工程技术一步法从粘粒中克隆了德胺糖的生物合成基因蔟的两个转录单元，重组效率高达100%。本方法避免了常规克隆手段的烦琐、耗时、针对长DNA片段的PCR易发生碱基突变等缺点。进一步，将两个转录单元分别置于来源于天蓝色链霉菌的pacI/pactIII双向启动子的控制下并克隆至链霉菌的游离型和整合型表达载体上。本工作为探索德胺糖生物合成基因蔟在异源宿主菌中表达、德胺糖与多种糖苷底物偶联以创制新化合物奠定了基础。 关键词：德胺糖；生物合成基因蔟；重组工程 Construction of desosamine biosynthetic gene cluster through recombineering 　　　　　　　　　Zhu Lei, Xie Feng and Shang Guang-dong (Key Lab of Biodiversity and Biotechnology of Jiangsu Province, College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210097) ABSTRACT Desosamine is an important sugar group of microbial medicines originated from secondary metabolites. Two transcriptional units of desosamine biosynthetic gene cluster were directly cloned from the cosmid via genetic recombineering, the recombination efficiency is as high as 100%.The cloning strategy gets around of the tedious, time consuming, and error-prone for long fragment PCR. The desosamine gene cluster was further put under the pactI/pactIII bidirectional promoter from the Streptomyces coelicolor, and cloned into the streptomyces free state expression vector and integrative vector, respectively. This work sets the stage for exploring of the heterologous expression of desosamine biosynthetic gene cluster and the coupling of desosamine with various glycon substrates. KEY WORDS desosamine; biosynthetic gene cluster; recombineering ____________________________ 基金项目：“十一五”863国家高技术研究发展计划(2006AA02Z159)。 作者简介：朱蕾，女，生于1983年,硕士研究生。主要研究方向为微生物药物学。 *通讯作者，Email:shanggd@ 　　　微生物药物分子生物学的迅速发展，使得对负责微生物药物的生物合成基因蔟的操纵成为一条可供选择的、也是有着极佳应用前景的创制新型微生物药物的手段[1]。重组工程在基因工程家族的一个较新的成员，由于微生物药物的生物合成基因蔟常常较大(数十至数百歌千碱基对)[3],常规分子生物学手段难以达到良好的效果，而重组工程由于可以简洁而高效地对DNA大片段进行操作，因此成为研究生物合成基因蔟的一个有力的手段[2]。如德国Rulf Muller研究组将散布在三个粘粒上的粘细菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1的“沉默基因蔟”以重组工程手段克隆后，转化至假单胞菌中，在苯甲酸诱导下，得到了PKS/NRPS型化合物Myxochromide，发酵两天产量就达到了40mg/ml，而原株发酵七天的产量仅为8mg/ml[4]