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真菌拮抗细菌筛选方法改进 摘要：通过对传统真菌的拮抗细菌的对峙培养筛选方法进行研究改进，克服在传统拮抗菌的筛选过程中所面临的一些问题，结合载玻片培养的载玻片筛选法，使真菌与细菌的作用距离更小，拮抗作用的观察更为直观，并易于量化设计，此法提高了真菌拮抗菌筛选的效率和准确率。 关键词：真菌；拮抗细菌：筛选：载玻片培养法 拮抗菌的筛选，在开发利用微生物的生物防治作用中是最基础的，因此提高筛选效率和准确性十分重要。在筛选真菌的拮抗菌过程中，普遍采用对峙培养法[1]，观察平板培养基中细菌和真菌对峙培养时，是按真菌菌落的大小来判断细菌拮抗性的有无。该方法有操作方便的优点，但无法避免一些实际问题。如对峙培养法筛选拮抗菌时不能有效的控制待选菌的生长量，因此无法判断其是营养竞争抑制还是其代谢的物质产生拮抗作用：在接种真菌时一般是用打孔器取长有真菌的培养基接种，这样真菌在平板上的菌龄不一样，即有的是菌落的中心部分，菌龄大，边缘部分菌龄小，他们有不同的生活力，因此在对峙培养中可能会出现假阳性现象：在对峙培养时平板的厚度和真菌菌种琼脂块与培养基的接触情况也将影响真菌菌落的生长情况：在筛选过程中我们很难在显微水平上观察到其拮抗效果。针对以上不足，我们设计了一种新的实验方法进行真菌的拮抗细菌筛选”“载玻片筛选法。 1 材料与方法 1.1 实验材料 脑心浸出培养基、水霉菌(Sa prolegnia．Spp)、从河鲈肌肉和粘液中分离得到的细菌。 收稿日期：20，I 6 -12 -2 9 +基金项目：鱼类水霉病病原生物接抗菌的筛选及其拮抗机理分析，项目编号 +通讯作者：王咏星(1965-)，女，副教授，硕士，研究方向为水生生物学。E．mail:wyxing65@126.com。 1.2 实验方法1.2.1 培养皿准备 在直径为9 cm的培养皿中铺上与其直径相当的滤纸片，放上三角棒和载玻片，然后经1 x105 Pa灭菌20 min后向培养皿中加入3~5 mL20%的无菌甘油溶液。1.2.2 培养基准备 向无菌培养皿中倒入15 mL冷却至50~60℃的脑心浸出培养基，并让其凝固后用解剖刀在培养基中割取1 cm xl cm的琼脂块，并将其挑出放于培养皿中的载玻片中央。 1.2.3 菌种制备 细菌经分离后保存，并以此为菌种进行筛选。水霉孢子液的制备方法参照张书俊等[2]，然后经进一步3 000 r/min离心处理5 min后取其上清液。 1.2.4 接种 1．平皿；2．三角玻璃棒；3．载玻片；4．盖玻片；5．培养基；6．保湿用滤纸：7．接种环接种：8．移液器接种 待测细菌用接种环接种在琼脂块的载玻片长轴一侧的侧面上，在其对面一侧的琼脂块上表面接种10 VL的孢子液，盖上盖玻片后培养。 1.2.5 结果观察 将培养过后的载玻片直接在光学显微镜下镜检，观察试验组和对照组的菌丝生长情况。经上述培养方式的结果如图2。 枯草芽孢杆菌（Bachellip;us sub tilis）对水霉菌的生长有营养竞争。与对照组比较，H J010和H J017表现出很强的拮抗作用，被抑制生长的水霉菌丝稀少，菌丝膨大，部分菌丝断裂，部分透明，已经发生凋亡。 2 结果与讨论 (1)经离心处理后的孢子液，可以保证在上清液中的孢子数在较低范围，培养过程中使各孢子分开生长，便于观察。(2)改进的接种方式使细菌和真菌生长的早期阶段彼此独立生长。细菌最后生长在琼脂块的四边的侧面上，而真菌在琼脂块的上表面生长，他们彼此独立生长。也有部分孢子在细菌生长区域萌发生长与细菌直接作用。盖上盖玻片的目的是为了阻止细菌在琼脂块的上表面生长。通过设立已知对实验真菌无拮抗作用的细菌为对照组，排除了营养竞争和供氧不足的可能性。(3)该方法实现了在载玻片上使细菌和真菌分别独立生长产生近距离作用。这样可以提高筛选时的辨别能力，即有较弱拮抗能力的菌株也可以筛选得到。(4)试验结果使用光学显微镜观察，克服了以前不能在显微水平上直接观察真菌与细菌同时培养时的拮抗效果。使真菌菌丝被抑制生长的结果可以直观观察。(5)通过不同的时间段观察，可以确定菌株的拮抗性大小，以及细菌与真菌直接作用和间接作用的结果，可进一步了解细菌的拮抗机制。 参考文献 [1]朱凤，陈夕军，水稻内生细菌的分离及其拮抗性与潜在致病性测定[J]，中国生物防治，2 0 0 7，23(1):68- 72. [2]张书俊，杨先乐，水霉拮抗菌的筛选及其拮抗作用的初步研究hellip;．水生生物学报，2 0 0 8，32 (3):30， I- 307． [版权归原杂志和作者所有，www. .com/jjgl/摘录自《新疆农垦科技》杂志,转载请注明出处和作者，仅供学习参考 ] /nonglin6836142.html　　 1