同位素稀释结合固相萃取快速测定动物组织中β2-兴奋剂.docVIP

同位素稀释结合固相萃取快速测定动物组织中β2-兴奋剂 吴平谷*1应永飞2 （1 浙江省疾病预防控制中心 杭州 310009 ） (2 浙江省畜产品质量安全检测中心 杭州310020 ) 摘要 ：本文采用同位素稀释结合固相萃取技术，测定动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺φ）TMCS衍生，采用GC--MS 进行测定，内标法定量。试验表明，动物组织中添加2.0~10μg/kg浓度水平的β2-兴奋剂，方法回收率在72.5—97.9%，变异系数1.0—11.4%，样品中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺 GC—5973MS色质联用仪 ； 超声清洗器、旋涡混匀器； 特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇（sigma公司）、莱克多巴胺标准品（浙江省兽药监察所提供 纯度大于98%）； 甲醇、盐酸、乙酸乙酯、氨水、无水硫酸钠等均为分析纯； BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%（φ）TMCS （三甲基氯硅烷）购与迪马公司 C18、SCX、WCX、SLS、SLC固相萃取柱：500mg/6ml购与杭州福裕科技服务有限公司； MCX固相萃取柱100mg/6ml购与Waters； 5%氨化乙酸乙酯：取0.5ml浓氨水加9ml乙酸乙酯，置于旋涡混匀器混匀，现配现用。 β2-兴奋剂标准储备溶液（1.0mg/ml）：分别称取4种β2-兴奋剂10mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用,标准使用液用甲醇稀释至0.1μg/ml。 D3-沙丁胺醇、D9-克伦特罗（100μg/ml）储备液：加拿大Palaloger博士惠赠，使用时用甲醇稀释至1.0μg/ml混合液。 1.2 实验条件 1.2.1 色谱条件 色谱柱：HP—5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；进样口温度280℃，柱温程序：初温120℃，保持3 min，然后以10℃／min升至280℃，保持5min ； 载气为高纯氦气（99.999%），流速0.9mL/min，不分流进样。 1.2.2 质谱条件 EI源 源温 230℃； 电子能量70eV； 接口温度280℃； 电子倍增器电压1506V ； 质量扫描范围30～550Μ；溶剂延迟：11 min 。 1.3 样品处理 1.3.1样品的提取 称取5.0 g经绞碎均匀的样品于50ml离心管中，加40μl1.0μg/ml D9-沙丁胺醇、D3-克伦特罗 混合液，静置10min，然后加入30ml甲醇匀浆，在超声清洗器中提取20 min，每隔5 min振荡一次，在4000r/min下离心10 min，分出上清液，在50℃下旋转蒸至5ml,加5ml正己烷脱脂后，氮气吹至1.5ml左右。用1.0mol/L盐酸调节pH至2.0,在12000r/min下离心10 min后上清液进行净化分析。 1.3.2样品净化 取SLS净化柱上，按照柱子使用要求进行活化,然后将上清液加到柱子上,然后用水、甲醇淋洗除杂，最后用10ml5%氨化乙酸乙酯（V：V）洗脱，洗脱液在水浴中氮气吹干。 1.3.3衍生 蒸发剩余物加0.1 ml BSTFA+1%（φ）TMCS，加盖瓶于旋涡混合器上震荡，在80℃的烘箱中加热1.0 h，氮气吹干，加0.2mL甲苯溶解。取0.1μg/mlβ2-兴奋剂标准使用液25μl、50μl、100μl、250 μl、500μl、1000μl，分别加40μl 1.0μg/ml D3-沙丁胺醇、D9-克伦特罗混合液氮气吹干，同时进行衍生化。取1.0μL甲苯溶液进行GC--MS分析， 1.3.4结果计算 内标法定量。 2结果与讨论 β2--兴奋剂是一类苯乙醇胺化合物，按照苯环上取代基不同分成苯胺型（如克伦特罗）、苯酚型，苯酚型又分邻苯二酚型、间苯二酚型（如特布他林、莱克多巴胺莱克多巴胺30 m×0.25 mm×0.25μmHP-1MS柱；（2）30 m×0.25 mm×0.25μmHP-5MS柱；（3）30 m×0.25 mm×0.25μmHP-1701柱。按照不同色谱柱进行色谱条件优化，然后对色谱图进行比较，发现柱（1）有拖尾现象，柱（3）基线漂移比较严重，柱（2）峰形以及分离度均较好，因此最后选择30 m×0.25 mm×0.25μmHP-5MS柱。4种β2-兴奋剂标准以及2种同位素内标标准品硅烷化衍生后总离子流图见1。 图1 标准品硅烷化衍生后总离子流 Fig.1 Total ion current chromatogram of standards by GC/MS 由图1可知，克伦特罗与D9-克伦特罗可以完全分开，而沙丁胺醇与D3-沙丁胺醇则不能分离，可以通过选择离子进行定性定量分析。 2.1.2质谱监测离子的确定 按照EC对兽药残留检测要