肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定.docVIP

　　肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定 摘 要:目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体. 方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI-neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI-asHAb18G.用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实:转染细胞HHCC/asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC/neu及HHCC均为强阳性. 结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G.为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础. 　　Keys;geic vectors;RNA，anti-sense;HAb18G/CD147 　　Abstract:AIM To construct eukaryotic vector expressing antisense RNA of HAb18G.METHODS PCI-asHAb18G a cell strain HHCC etry as-say and indirect immunofluorescence staining.RESULTS It munofluorescence staining and fluorocytometric assay shoa. 　　0 引言 　　HAb18是我室用肝癌抗原免疫小鼠得到的特异性单克隆抗体（mAb）［1］ ，该mAb药物已进入Ⅱ期临床［2］ .我们构建了人肝癌组织cDNA文库［3］ 并用HAb18mAb从其中筛选得到其相应抗原HAb18G，查询Genebank发现其基因序列与CD147分子序列一致.CD147分子，又名EMMPrin（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子），最初源于人肺癌细胞系LX-1，在肝癌组织中发现尚属首次，它具有刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（MMPs）的功能［4］ .MMPs能降解细胞外基质因而在肿瘤的侵袭和转移中起到重要的作用［5］ .为研究HAb18G与肝癌转移的关系，我们构建HAb18G反义RNA真核表达质粒，并观察其对人肝癌细胞HAb18G的表达的抑制作用. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pBluescript ks（+）/HAb18G由本室构建，内含HAb18G的全长cDNA编码序列;PCI-neo真核表达质粒购自Promega公司;宿主菌大肠杆菌JM109及肝癌细胞株HHCC由本室常规保存;Lipfectinamine2000 脂质体转染试剂盒购自Gibco公司，质粒提取试剂盒、G418购自Promega公司，限制性内切酶，T4连接酶购自宝泰克公司;凝胶纯化试剂盒购自Clontech公司;抗人肝癌的鼠单克隆抗体HAb18由本室制备;免疫组化SP染色试剂盒购自福州迈新公司. 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA操作与克隆 DNA操作包括感受态菌株的制备，质粒的扩增、提取，限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳分离均参照文献［6］进行，PCI-neo及pBlue-script ks（+）/HAb18G质粒分别经XbaⅠ及XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶纯化试剂盒纯化相应的DNA片段.用T4噬菌体DNA连接酶将1.7kb左右HAb18G cDNA全长序列反向连接到PCI-neo真核表达质粒的XhoⅠ-XbaⅠ间，构建成PCI-asHAb18G反义RNA表达载体，转化感受态细菌JM109，随机挑选氨苄抗性的转化克隆，限制性内切酶酶切鉴定. 　　1.2.2 插入片段部分序列的分析 以T3 启动子序列为测序引物，直接以构建的PCI-asHAb18G反义RNA表达载体为模板，用全自动荧光DNA序列分析仪进行单向DNA序列分析. 　　1.2.3 反义RNA抑制HAb18G表达 用阳离子脂质体Lipfectinamine2000 介导将空质粒表载体PCI-neo及重组质粒PCI-asHAb18G转染至人肝癌细胞HHCC，分别命名为HHCC/neo和HHCC/asHAb18G，并以HHCC作为阴性对照.具体操作步骤参照说明书及文献［7］进行.转染第2日将细胞以1∶6的稀释比例传代培养，2d后用含400mg#12539;LG418的选择培养液连续培养4g#12539;L-1 ）下常规培养扩增. 　　1.2.4 转染细胞的免疫组织化学染色 取经转染的细胞爬片，经冷丙酮固定，进行SP（链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶）法染色，（具体操作步骤参照