ABCA1调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的探究.pdfVIP

ABCA1 调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的研究 中文摘要 ABCA1 调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的研究 第一部分：针对大鼠肺泡巨噬细胞上ABCA1 表达的siRNA 筛选及转染 复合物细胞毒性的检测 目的 筛选有效抑制大鼠肺泡巨噬细胞上ABCA1(ATP-binding cassette transporter A1 )表达的小干扰RNA(simall interference RNA ，siRNA)序列，并检测转染复合物的 细胞毒性。 方法 设计并合成针对ABCA1 的siRNA 3 条(siRNA1172 , siRNA5948 ,siRNA6072 )及 1 条与 ABCA1 基因无同源性的带绿色荧光标记的阴性对照 siRNA，在 HiPerFect Transfection Reagent 介导下转染大鼠肺泡巨噬细胞。用RT-PCR 方法测定干扰后大鼠 肺泡巨噬细胞上ABCA1 mRNA 表达，流式细胞术方法测定干扰后ABCA1 蛋白表达， 比较其抑制率，筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。采用MTT 法检测转染复合物 的细胞毒性。 结果 ① siRNA(50nmol·L -1 )和HiPerFect Transfection Reagent(6µL)有较高的转 染效率；② 与阴性对照组相比，ABCA1 siRNA(50 nmol·L -1 )干扰大鼠肺泡巨噬细 胞 24 h 后 ABCA1 mRNA 的相对表达量降低，分别降低：71.97%(siRNA1172 ）, 77.96%(siRNA5948 ）, 76.73%(siRNA6072 ）。③ 与阴性对照组相比，ABCA1 siRNA(50 nmol·L -1 )干扰大鼠肺泡巨噬细胞 48 h 后 ABCA1 蛋白表达降低，分别降低： 65.88%(siRNA1172 ）, 63.88%(siRNA5948 ）, 62.17%(siRNA6072 ）。 结论 ① 三条siRNA 均可有效抑制大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1 的表达。② 转染试剂 HiPerFect Transfection Reagent 6µl与终浓度为50 nmol·L -1 siRNA，为合适的转染比 例。 关键词：肺泡巨噬细胞；ATP结合盒转运体A1 ；小干扰RNA ；筛选；转染复合物； 细胞毒性 第二部分：ABCA1 调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的研究 目的 观察脂多糖（LPS)对大鼠肺泡巨噬细胞ATP 结合盒转运体A1(ATP-binding I 中文摘要 ABCA1 调节大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应过程机制的研究 cassette transporter A1 ，ABCA1)表达的影响, 以及ABCA1 对于大鼠肺泡巨噬细胞表面 Toll 样受体4 （Toll-like receptor 4,TLR4) 的影响，探索在LPS 诱发的大鼠肺泡巨噬细 胞炎症反应过程中，ABCA1 的调节机制。 方法 分别以不同浓度的LPS （0，0.2 ，2 ，20 ，200 µg/L)作用于大鼠肺泡巨噬 细胞，24h 后采用RT-PCR 方法测定大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1 mRNA 表达，流式细 胞术方法测定ABCA1 蛋白表达。以相同浓度的LPS （20µg/L ）作用于大鼠肺泡巨噬 细胞，于不同的时间点（0，2 ，6，12，24 h), 采用上述方法分别测定ABCA1mRNA 和蛋白表达。此外，联合使用20µg/L LPS 以及特异性抑制ABCA1 表达的siRNA 干 扰大鼠肺泡巨噬细胞，12h 后，采用上述方法分别测定TLR4 mRNA 和蛋白表达。 结果 ① LPS 呈浓度和时间依赖性抑制 ABCA1 mRNA 及蛋白质的表达 （P0.05) 。② 大鼠肺泡巨噬细胞ABCA1 的表达被特异性siRNA 抑制后LPS 引起的 T