BDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对脊髓缺血再灌注损伤保护作用的探究.pdfVIP

·中文论著摘要· BDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞 移植对脊髓缺血再灌注损伤保护作用的研究 目 的 cord 脊髓损伤(spinalinjury，ScI)包括原发性损伤和继发性损伤。继发性 损伤是原发性损伤后出现的一系列病理改变，其发病机制极其复杂，脊髓中的神 经元再生非常有限，脊髓损伤常导致诸如截瘫、四肢瘫痪等严重的功能障碍n一。 其中，缺血再灌注损伤是造成神经损伤的一个重要因素。脊髓缺血再灌注损伤的 具体机制尚不清楚，氧自由基介导的脂质过氧化反应、钙离子超载、兴奋性氨基 酸、前列腺素等因素在脊髓损伤机制中起重要的作用已得到公认m1。通过转基因 技术，使含神经营养基因的细胞分泌神经营养素，促进神经功能恢复成为近期研 究的热点硒J1。 derived 脑源性神经营养因子(brain neurophicfactorBDNF)是一种重要 的神经营养因子，可改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生、减少神经 元凋亡∞。本课题组前期研究发现干细胞移植能改变脊髓内微环境，并使BDNF表 达增多，但内源性BDNF的表达不足以修复脊髓损伤。骨髓间充质干细胞(bone stemcells，BMSCs)的来源广泛，易于获取并在体外扩增，可以获 mesenchymal 得足够数量的细胞用于细胞治疗㈣¨。不仅易于外源基因的转染和表达，而且转染 外源基因并不影响BMSCs多向分化能力和体外增殖能力，因此。BMSCs可以作为 一种新型的基因治疗的靶细胞。由于所携带的外源基因可表达部分调控损伤部位 微环境的神经因子，从而促进BMSCs向神经元和少突胶质细胞分化n铂。绿色荧光 蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)不影响细胞的活性或功能，已被广泛用 于监测活组织及固定后组织的基因表达、蛋白定位及移植细胞的示踪n引町。国内 外研究者成功构建了BDNF-GFP质粒并在BMSCs中表达，既能促进神经元的生长， 又能进行很好的示踪，有很好的应用前景“纠刀。 转染的BMSCs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，检测其对脊髓损伤的修复效 果并探讨可能的相关机制。 方法 一、大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 1．应用贴壁培养法培养大鼠BMSCs。 2．绘制第三代BMSCs的生长曲线。 3．应用流式细胞仪检测大鼠第3代BMSCs的表面标志物CD34、C044、CDgO． 1．扩增提纯重组质粒pEGFP-NI-BDNF。 2．对构建的pEGFP-NI-BDNF重组质粒进行HindlIl／KpnI双酶切鉴定。 方法和Western 型后对脊髓损伤后神经功能修复情况 1．建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，实验分组。 2．后肢运动评分。 3．各组大鼠术后1w脊髓HE染色。 4．免疫组化检测各组大鼠术后1w脊髓BDNF表达。 5．免疫组化检测各组大鼠不同时间点脊髓caspase一3免疫组化阳性细胞计 数情况。 结 果 一、成功分离、培养并鉴定大鼠BMSC$ 1．原代和传代培养大MBMSCs贴壁生长良好，形态为较一致的长梭形、纺锤 形。10一14d时集落边缘汇合，细胞呈较均一的旋涡状或螺旋状分布。 2 2．体外分离培养的BMSCs能够较好的扩增，与其他细胞相同，均经历了潜伏适 应期、对数生长期和生长平台期。 3．应用流式细胞仪检测大鼠第3代BMSCsI狗表面标志物CD34阴性。阳性率为 90阳性，阳性率为98．98％。 0．97％；CD44阳性．阳性率为97．57％；CD 1．重组质粒pEGFP-N1-BDNF扩增提纯成功。 另一条与BDNF]j的基因序列(775bp)吻合。 应用ELISA方法和Western 表达量明显高于对照组。 三、BDNF—GFP转染的BMSOs移植入大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型， 可明显改善脊髓损伤后神经功能恢复 1．成功建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。 Tarlov评分显著增高，瘫痪