最主要的连接方法单一限制性内切酶.pptVIP

DNA重组技术 DNA重组技术： 按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞 中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 （二）目的DNA片段与载体的连接 DNA连接酶 酶促生化反应 粘性末端的DNA分子最容易相互连接，连接效率也是最高的。 连接反应的最适合温度是12~16度 克隆载体具备的特征： 1 载体必须具有自我复制和表达的能力 2 载体不能过大 3 载体与宿主细胞容易分离和纯化 4 具有两个以上的遗传选择标记，便于区别阳性和阴性克隆 特征 功能 在宿主细胞内稳定 允许复制 能控制自身复制 在细胞内复制高拷贝数 大小较小 容易转化，进入宿主细胞 存在限制性内切酶单一 允许供体DNA插入和质粒环化 酶切位点 不能通过接合转移 阻止重组DNA进入菌群 易于检测的特性，具有 可以区分转化和未转化细胞 两个以上的检测位点 容易从细胞中分离 容易得到高产量重组体 （一）DNA重组的方法1、分类： 粘端连接法  平端连接法 依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶酶切位点的性质来做选择。 1 粘性末端连接法（cohesive end ligation） 最主要的连接方法 单一限制性内切酶——粘性末端 两个限制性内切酶——互补粘性末端 目的基因或DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，通过连接酶将其连接。 ◇同源粘性末端：相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。◇特点：得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。 除了重组体以外，还有质粒分子的自身环化，重新形成完整质粒，这是基因重组中产生了假阳性。 如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？ 1 连接前使用碱性磷酸酶，去除载体5`端的磷酸抑制质粒的重新环化。 2 调节外源DNA 和克隆载体的比例 3 定向克隆，使用两个限制性内切酶  1）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的5’磷酸以抑制质粒DNA的自身环化。2）用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA，连接时插入片段可以两个方向插入载体中。3）片段的多拷贝插入 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为3：1 2 同聚体加尾部连接法： （homopolymeric tails ligation） 针对平性末端或者不匹配的末端 利用末端核酸转移酶在一个分子的末 端加上poly(A);另一个分子3`末端加上 poly(T),在通过DNA连接酶形成重组 DNA分子。 （1）限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源DNA片段和载体是两个不相配的DNA片段；（2）用末端转移酶使其中的一个DNA分子3’端上接上多聚A,另一个DNA片段3’端上接上多聚T。（3）使两个DNA分子的尾部可按A-T配对原则相联 （4）DNA聚合酶填补空隙（5）DNA连接酶封口成重组DNA分子 3 人工合成接头连接法 人为的在目的基因的两端加上酶切位点，使得限制性内切酶酶切后与载体形成相同的粘性末端 （1）目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一  限制性内切酶识别的DNA序列（接头）（2）在该内切酶的酶解作用下，与载体获得 相同的粘性末端（3）连接 （二）重组DNA分子转入宿主细胞 什么是转化（transformation）？ 将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。 什么是转染（transfection）? 将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。 宿主细胞  原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞  1 重组体分子导入原核细胞 感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收 （1）CaCl2转化： [原理]： 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的D