芋螺毒素mria的串联表达纯化及生物活性鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（５）：８１８８ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 芋螺毒素ＭｒＩＡ的串联表达、纯化及生物活性鉴定 １，２，３ １ １ １ １，２ １，２ 朱晓鹏 　张亚宁 　于津鹏 　李晓丹 　罗素兰 　长孙东亭 （１海南大学热带生物资源教育部重点实验室　海口市海洋药物重点实验室　海口　５７０２２８） （２海南大学海洋学院　海口　５７０２２８　３海南大学园艺园林学院　海口　５７０２２８） 摘要　芋螺毒素（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ，ＣＴｘｓ）是一类特异作用于离子通道和膜受体的小分子多肽，是研究受 体结构和功能及其相关疾病的重要工具。ＭｒＩＡ是进入临床研究可用于镇痛治疗的一种Ｔ超家族 的芋螺毒素。传统获取芋螺毒素是通过化学合成的方法，成本高、产量低。实验利用串联表达技 术，构建原核表达载体，在大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）中成功表达了芋螺毒素 ＭｒＩＡ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭｒＩＡ，ｒＭｒＩＡ）。通过溴化氰切割和纯化，最终１Ｌ菌液可获得纯度高达９５％的ｒＭｒＩＡ ３０ｍｇ。小鼠热板实验表明，ｒＭｒＩＡ具有较好的镇痛活性。这为大量获得 ＭｒＩＡ以及其他芋螺毒素 小肽的表达提供了方法。 关键词　芋螺毒素ＭｒＩＡ　融合表达　纯化　热板实验　电生理 中图分类号　Ｑ７８ ［８］ 　　芋螺毒素（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ，ＣＴｘｓ）是海洋肉食性软体动物 Ｂａｌａｊｉ等 分别从大理石芋螺（Ｃｏｎｕｓｍａｒｍｏｒｅｕｓ）获得 芋螺（Ｃｏｎｕｓ）分泌的一类活性多肽，它们具有分子质量 的一种新型 Ｔ超家族芋螺毒素。ＭｒＩＡ属于  χ 小、序列超变异、富含二硫键和作用靶点广泛等特点。 ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ，能特异地抑制去 甲肾上腺素转移体 ＣＴｘｓ能特异地作用于体内各种电压门控离子通道（Ｎａ、 （ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ＮＥＴ），ＮＥＴ是治疗神经性疾 Ｋ、Ｃａ）、配体门控离子通道（乙酰胆碱受体、５羟色胺受 ［９］ 病，如抑郁、焦虑、强迫症等重要靶点 。在大鼠急性 ［１３］ 体等） 。全世界有超过５００种芋螺且每种芋螺中包含 炎症神经痛模型上，ＭｒＩＡ也表现出了良好的镇痛效 ［７，１０］ １０００多种ＣＴｘｓ，不同种类之间只有大约５％的ＣＴｘｓ重 果 。 ＭｒＩＡ 的 类 似 物 Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ１ＭｒＩＡ ［４］ ［１１］ 叠 ，然而目前只有不到０．１％的ＣＴｘｓ得到研究。由于 （Ｘｅｎ２１７４）已经进入临床 期 。 Ⅰ 芋螺毒素分子质量小、选择专一性强，因此成为神经科学 　　由于近几年环境破坏加剧，造成芋螺资源匮乏，而 和药物学研究的重要探针，引起了人们的广泛注意［５］。 化学合成毒素成本高，毒性大等因素，限制了芋螺毒素 　　ＣＴｘｓ按照其信号肽序列和半胱氨酸（ｃｙｓｔｅｉｎｅ， 的研究。本研究按照Ｅ．ｃｏｌｉ偏爱密码子设计 ｍｒｉａ基 Ｃｙｓ）模式的不同，可以将其分为若干超家族：Ｏ、Ｍ、 因，将基因串联后与表达载体ｐＥＴ３１ｂ（＋）连接，构建