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1. 组织RNA及组织、细胞蛋白提取 1.1组织RNA提取 使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并对粉碎的组织进行匀浆。匀浆或裂解后样品于15～30孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。Trizol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。取100mg组织匀浆置于1.5ml EP管中，向每个EP管加入1ml Trizol 试剂并颠倒混匀。打开管盖，向每管加入相当于Trizol体积1/5的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置3min。4℃低温离心机，12,000×g 离心15min。离心后自然分出上层无色水相和下层有机相，RNA存在于上层。将上层水相液体小心吸到新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置5min，4℃低温离心机，12,000×g 离心10min。离心后，管底会出现白色沉淀，吸走上清液，加入1ml的75%乙醇，洗涤RNA沉淀。上下颠倒后，4℃，10,000×g离心5分钟。小心去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10分钟。使用去RNA酶水彻底溶解RNA，用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳法评估RNA完整性。获得的RNA溶液立即用于逆转录反应，合成cDNA。细胞RNA 500ul 静置15min 100ul 三氯甲烷，30s，放置10min 12000离心15min 200ul上清移入EP管中，等量异丙醇，10min 4℃ 12000离心10min， 500ul 乙醇， 4℃ 7500离心5min，上清 后用DEPC水溶解，20ul,量多50-100ul 所需溶液： 1 DEPC处理水：DEPC 1ml加入1L双蒸水中，室温搅拌4h以上至完全溶解，高温灭菌30min。 1.2 组织蛋白及细胞蛋白提取 蛋白的抽提使用Biopulverizer冰冻粉碎组织并对粉碎的组织进行匀浆。每100mg组织匀浆加入?T-PER Tissue Protein Extraction Reagent?试剂1ml。操作全程在冰上进行，避免组织蛋白降解。组织裂解液用BCA蛋白浓度测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）检测蛋白浓度。测定浓度后，向每管蛋白裂解液中加入5×Loading Buffer以及β-巯基乙醇至1×浓度。加入Loading Buffer 后混匀蛋白裂解液，后在100煮沸5-10min使蛋白变性，冻存于-20备用。 细胞蛋白的抽提用 l×PBS洗细胞三次，10cm培养皿加入500μl的IP裂解液（IP细胞裂解液，Beyotime，碧云天，江苏海门）和PMSF，6cm培养皿加入220μl的IP裂解液和PMSF，六孔培养板中每孔加入100ul的IP细胞裂解液，冰上裂解 10min，刮下细胞；然后12,000g、4离心10分钟，将上清移入灭菌eppendorf管中，分装，每管加入5×Loading Buffer和β-巯基乙醇，100煮5min，冷却至室温后-80冰箱冻存。 BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量梯度稀释标准蛋白将BCA反应试剂A与试剂B按照50:1的比例混合，制成工作液;酶标板中加入5ul标准蛋白或5ul样品，再加入100ulBCA工作液，震荡混匀37℃孵育 30min酶标仪读取 570nm吸光度值以吸光度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。 2.1总RNA逆转录反应 逆转录合成cDNA：RNA溶解后在0.65mlPCR管中配置反应溶液，反应体系见表1；逆转录反应前，所以样品RNA稀释到500ng/μL浓度作为逆转录反应模板。表1. 总RNA逆转录反应体系 成分 体积/反应（ul） 10× RT Buffer 2.0 25× dNTP Mix (100nM) 0.8 10× RT 随机引物 2.0 Multiscribe Reverse Transcriptase 1.0 DEPC水 4.2 总体积/反应 10 加样后将反应管置于PCR仪，反应条件为37 30分钟→85 5分钟→4保存。2.2目的基因的实时定量PCR检测 2.2.1 Realtime PCR引物设计：根据待检测基因标准序列，通过Primer6.0软件设计正义、反义PCR引物，并利用NCBI在线引物设计及特异性检验工具Primer BLAST进行引物检验。表2是待测基因的序列表。 表2. 待检测基因及内参基因realtime PCR引物信息 Table 2. Realtime PCR primer for candidate genes and endogenous reference gene 基因名 引物序列 引物长