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Ch5 酶固定化技术及固定化酶反应器 固定化酶于20世纪，50年代开始研究，到70年代产业化应用的一项酶工程新技术；就是将游离的酶蛋白分子固定在不溶性载体上，应用于工业化生产；因此，酶固定化技术是将酶蛋白固定在一定的载体上的方法; 酶固定化技术主要解决以下几个方面的问题: ① 增加酶稳定性。 ② 改善酶制剂的应用工艺。 ③ 使酶蛋白得到重复使用。 ④ 便于使酶蛋白与催化产物分离。 Ch5－1 酶固定化方法 / 技术 按固定化反应类型分, 酶固定化方法分以下四种 吸附法 共价法 交联法 包脉法 近年来人们将吸附法和交联法结合起来，建立了吸附－交联法 Ch5－1 酶固定化方法 / 技术 1 吸附法固定化技术 此法是酶固定化研究最早的方法, 以吸附剂作载体, 利用物理吸附的原理,对酶蛋白进行固定化的一种方法。 此法的优点是: 固定化酶的制备简单; 酶固定化载体的再生方便; 缺点: 酶与载体的结合不牢固, 在固定化酶的应用过程中, 受到介质的 pH、离子强度、反应温度等因素的影响。 Ch5－1 酶固定化方法/技术 2 交联法固定化技术 交联法 交联法是利用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与载体之间发生交联反应, 制成具有网状结构的固定化酶的方法。 常用的双功能试剂有: 戊二醛： [OHC－(CH2)3－CHO] 最常用的是戊二醛, 戊二醛有; 两个醛基, 这两个全集醛基都可以与酶蛋白分子上的游离氨基发生反应,戊二醛本身起到分子间桥作用。 反应式如: OHC－(CH2)3－CHO＋n[E]= －CH=N－E－Ｎ＝CH－－－ 己二胺： 顺丁烯二酸酐等; Ch5－1 酶固定化方法/技术 3 吸附－交联法固定化技术 吸附－交联法是将吸附法和交联法结合起来，建立的一种良好方法，两种方法的结合，在一定程度上克服了2种方法的不足。 ① 吸附法酶与载体结合不牢固； ② 交联法酶与载体交联效率低； ③ 交联法载体局限性； Ch5－1 酶固定化方法/技术 3 吸附－交联法固定化技术 吸附交联法固定化酶蛋白的基本操作过程: A 吸附条件测定:主要包括 基质的离子强度、pH、酶蛋白与载体的最佳比例、吸附完成时间。 B 吸附： 在测定吸附条件后, 进行酶蛋白的吸附, 在进行吸附时, 要进行不断的搅拌, 但搅拌的述度不能太快, 太快反而不利于吸附进行。 C 加交联剂: 交联剂的用量因不同的酶蛋白而不同, 交联剂加入量不够, 交联反应进行不完善, 酶固定化反应不牢固, 交联剂加入过多, 过渡的分子内交联反应, 影响酶活收率；交联反应时间一般1小时即可完成(戊二醛作交联剂)。 D 固定化酶的洗涤, 除去游离酶, 测定固定化酶的酶动力学参数和酶活收率。 Ch5－1 酶固定化方法/技术 4 共价结合法固定化技术 共价结合法是将酶蛋白分子上的功能基团与载体表面上的反应基团之间形成共价键, 以实现酶蛋白与载体之间的牢固结合的方法。此法的优点是酶蛋白与载体之间结合得非常牢固, 在使用过程中, 不会发生酶蛋白的脱落现象; 但此法也有明显的不足, 即固定化酶的载体不易再生, 载体不易重复使用, 固定化反应条件不易控制, 对固定化酶蛋白的分子结构必须清楚。 在进行固定化反应时, 首先要考虑的是参加共价反应的功能基团不能是酶蛋白的活性中心的氨基酸残基, 否则固定化反应将影响酶蛋白的催化活力。 Ch5－1 酶固定化方法/技术 5 包埋法固定化技术 包埋法 包埋法是将酶蛋白分子固定在高分子聚合物网格内或包埋在高分子半通透膜中, 将酶蛋白控制在一个半封闭的空间，这种固定化方法即为包埋法。 网格包埋法： 常用的高分子聚合物是聚丙烯酰氨, 将丙烯酰氨单体和双丙烯酰氨以及待固定的酶蛋白混合在一起, 在催化剂的作用下, 发生聚合, 将酶蛋白分子固定在聚合形成的聚丙烯酰氨的网格内。 * * 固定化酶的制备原则： ⑴ 固定化处理后不能改变酶的专一性 及其它催化特性； ⑵ 固定化载体应有一定的刚性，有利于固定化酶的应用工艺自动化； ⑶ 固定化处理应有尽可能小的空间位阻，不影响酶活性中心的临近 和定向效应； ⑷ 酶与载体的结合要牢固，一般不受应用环境条件的影响； ⑸ 固定化处理后，酶活性的稳定性要有明显改善； ⑹ 固定化酶制剂的生产成本要低。 常用的固