人逼尿肌细胞肾上腺素能β-%2c3-受体基因亚型细胞培养及干预性实验.pdfVIP

粒结合在脂质体上。 (3)将混合液在室温放置IO—15分钟。 (4)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 (5)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 (6)弃去细胞中的旧液，用ImL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔 -131．PGS质粒和D2．PGS质粒——脂质体混合物加入新鲜10％ FCS的DMEM，2mL／孔，再培养48小时。 (8)用消化法收集细胞。 二、正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞的p．AR受体表达鉴定 (一)RT—PCR 1、主要试剂 RNA提取试剂TRlzol 司产品；逆转录试剂SUPERSCREPlrrM Kit为GIBCOBRL PreamplificationSystem 公司产品；Dnasei LA PCRTM 公司 2、主要仪器设备 M几LIPoRE 超纯水装置一美国 MILLI-Q； 实验室制冰机一德国ZIGERA2BE-70-35； 振荡水浴箱一美国 GFLⅡⅢRMOLAB； MDF．U4086S； 超低温冰箱一日本SANYO 鼓风干燥箱一中国余姚TDW； GENE 旋涡振荡器一美国VORTEX．2 1．13 小型台式离心机一美国SIGMA inoLab PH计一德国WnV 3 UV-310 紫外分光光度计一英国PYE．UNICAM／SPECTRONIC Sub-cellGT 琼脂糖水平板电泳系统一美国BIO-RAD PROTEAN3 PowerPae200／M1NI 通用电泳仪一美国BIO-RAD 自动电泳凝胶成像分析仪一美国ALPHAINNOTECHChemiimager5500 ST-21 台式低温高速冷冻离心机一美国Sigma公司3K30／SORVALL 磁力搅拌器一中国温州DSHK-4 HVE·50 电动高压消毒箱一美国HIRAYAMA 液氮罐一中国成都YDS．10型 快速混匀器中国江苏SZ-I 超声波清洗器中国昆山KQ一100 PFA800／9600／9700型一美国PERKIN-ELMER UNO II／T 3、实验步骤 (1)正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞中总RNA的提取 机中4C12000转离心3分钟。 ②离心后抽取上清液至3个管中(每管大约lml)，分别加入1／5体积氯仿 (200“l卜—振荡器振荡——室温静置3分钟——再次离心12000转lO分钟。 ③离心后再次抽取上清液至3个管中(尽量多取上清液，但不要触及中间层 分钟一14000转离心15分钟。 转5分钟一弃去上清一静置10．15分钟(盖上面巾纸，直至无乙醇味卜一加入 ⑤l％低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性。 (2)RT-PCR引物的设计与合成 设计引物，扩增目的基因。 4 引物序列如下： pI．AR 正义引物：5’．CGGGCAATGTGCTGGTGA-3’ 反义引物：3LGGA